HBV YMDD变异检测方法的建立及临床应用的初步研究

【摘要】：目的 拉米夫定是近年用于抗HBV的主要药物之一,它可明显抑制HBV的复制,进而达到控制炎症、稳定病情甚至阻止肝纤维化的进展,但抑制病毒复制作用短暂,易于复发。随着用药时间的延长,在药物和人体免疫选择压力下可产生耐药。YMDD是拉米夫定抗HBV治疗最常出现变异的区域,一旦出现YMDD变异株,可能会伴有HBV DNA水平反跳和肝功能变化,甚至导致病情恶化。故开展YMDD变异的检测很有必要,对及时调整治疗方案、合理用药及提高疗效具有重要意义。本实验利用错配PCR扩增技术进行HBVP基因YMDD变异的检测,以评价其临床应用价值,并对HBV P基因YMDD变异的临床意义进行初步探讨。 方法 采用基因扩增技术检测时,其中一条引物3’端第2位碱基与目的基因对应的碱基不互补。根据YMDD变异的位点,分别设计不同的引物,扩增出需要得到的不同变异位点的DNA片段。 1.应用分子克隆方法建立阳性对照系统,构建YMDD、YVDD、YIDD的阳性质粒。 2.对所构建的质粒应用PCR方法、酶切鉴定及直接测序方法进行鉴定,并且进行敏感性及特异性试验。 3.对65例未经抗病毒治疗的乙型肝炎患者检测其YMDD变异情况。 4.对30例经拉米夫定治疗一年,HBV DNA持续阳性的患者,检测其YMDD变异情况。 结果 1.应用PCR方法、酶切鉴定及直接测序方法证实构建的YMDD、YVDD、YIDD质粒序列正确。 2.YMDD、YVDD、YIDD质粒具有较高的敏感性和特异性,三种质粒可检测出的最低浓度分别为1.87copies/μl、1.53copies/μl、1.53copies/μl。YMDD质粒在浓度为1.87×10~9copies/μl、YVDD、YIDD质粒在1.53×10~8copies/μl以下时不出现假阳性结果。 3.65例未经拉米夫定治疗的乙型肝炎患者中6例存在YMDD变异,阳性率为9.07%。其中YIDD和YI/YMDD各1例,YVDD3例,YV/YMDD1例。出