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表达幽门螺杆菌鞭毛粘附素的重组大肠杆菌ghost型疫苗的制备及鉴定

王宁  
【摘要】:幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp) 是一种定植于胃内的革兰氏染色阴性、螺杆状或S 状的微需氧菌,可引发慢性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡等上消化道疾病,并与胃癌、胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤的发生有关。由于传统的抗生素疗法面临着价格高、耐药性等诸多问题,开发有效的Hp 疫苗成为防治Hp 感染的研究热点。目前研发的Hp 疫苗,多是采用基因工程获得HP 的有效抗原,再辅以佐剂,如福氏佐剂、CT、LT,脂质A,但这些佐剂都只是非特异地加强抗原的免疫效应。而传统的灭活疫苗虽有好的保护作用,但是现用的加热、照射、化学处理等灭活方法,常常引起抗原性的降低和改变。 “Bacterial ghost”作为一种新型疫苗或抗原递送系统,是通过控制PhiX174 噬菌体E 裂解基因在细菌中表达得以制备的,其实质是一种无细菌胞浆和核酸的空细菌外膜。据报道,E 裂解基因编码的蛋白在细菌胞壁上可形成穿膜隧道,通过此隧道胞浆成分全部渗出。因为这种形式保留了和活菌一样完整的细菌胞膜结构和相关抗原蛋白,故而能够携带外源抗原靶向黏附于体内黏膜组织并易于被相应抗原提呈细胞捕获。Hp 粘附于胃上皮细胞是其定植进而致病的前提,有效阻断Hp 粘附是防治Hp 感染的途径之一。现在认为幽门螺杆菌黏附素A(Hp adhesion A,HpaA)是Hp 的主要黏附因子,该蛋白为Hp 所特有的抗原成分,其氨基酸序列高度保守,且多数Hp 感染患者血清中能检测到HpaA 抗体,因此可作为理想的Hp 疫苗靶抗原。 本课题尝试用“Bacterial ghost”这一新型疫苗递送形式和内佐剂来传输HpaA 抗原,拟构建表达HpaA 的重组大肠杆菌ghost 疫苗,即先把HpaA 锚定表达于大肠杆菌的胞膜,然后诱导细菌裂解以制备表达HpaA 的重组大肠杆菌ghost。本研究中,在成功制备大肠杆菌ghost 的基础上,采用两种技术路线制备表达HpaA 的重组大肠杆菌ghost:一种为双质粒共表达法,即将含裂解基因盒的裂解质粒pHH43 和含hpaA 表达盒的表达质粒pBIOEX-E’-hpaA 同时转入大肠杆菌BL21,先IPTG 诱导HpaA 表达,再热诱导E 裂解蛋白表达以制备重组ghost;二为单质粒双表达法,即将裂解基因盒和hpaA 表达盒构建到同一质粒pET-28a 上,先IPTG 诱导表达HpaA 蛋白,再用热诱导表达E 裂解蛋白而获得重组ghost。主要研究内容简述如下:


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