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HCMV UL82基因重组质粒在HFF中的表达与纯化鉴定

马强  
【摘要】:人巨细胞病毒含有约20~25 种蛋白质,其中在介导HCMV 感染和病毒复制中有3种蛋白作用最为重要,即由ORFUL82 编码的磷蛋白pp71、ORFUL83 编码的pp65 和ORFUL69 编码的PUL69。上述3 种蛋白共同的特点是启动HCMV 对宿主细胞的感染和病毒的复制,同时在逃逸T 淋巴细胞介导的细胞毒性作用中也具有重要作用。新近的研究表明,在这3 种间层蛋白中以ORFUL82 编码的蛋白pp71 的作用最为显著,该pp71蛋白单独存在时,是一种较强的抗原蛋白,可刺激机体产生抗体,有助于清除病毒;在器官移植者,HCMV 感染后pp71 蛋白的产生可以明显增强细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达,从而引起移植物血管病变和排斥反应。在视网膜母细胞瘤,pp71 蛋白的产生可以引起肿瘤蛋白P105、P107、P130 等的衰变。pp71 蛋白可以诱导静止的细胞进入细胞周期并使它们停止在G1晚期,而这段时期对病毒复制最为有利,所以它能够增加病毒繁殖,加快病毒在细胞间传递,体外将HCMV 转染人纤维细胞后,病毒DNA 复制效率在共转染ORFUL82 条件下,感染及复制效率增加了80 倍。研究证实pp71 不仅对HCMV 的IE1 和IE2 基因表达有促进作用,而且对晚期基因的表达以及病毒向正常宿主细胞的传播具有促进和加强作用。因此,Baldick 指出,ORFUL82(pp71 蛋白)可作为抗HCMV 病毒药物设计的有效靶点。 为进一步研究pp71 蛋白基因在真核细胞-人包皮成纤维细胞(HFF)中的表达,为抗HCMVpp71 间层蛋白人源化基因工程抗体库的建立、筛选奠定基础,本研究进行了以下工作: 1. 人包皮成纤维细胞的培养 取已冻存的第3 代HFF 细胞,在含10%小牛血清(FBS)的DMEM 完全培养基中培养,待细胞生长接近铺满培养瓶壁时,按1:3 分瓶培养,并标记传代时间,代数及细胞名称,于37℃、5%CO_2孵箱中继续培养。将传至对数生长期的第14 代HFF 细胞封管冻存,以备后用。 2. 基因重组质粒pSG5-pp71 的鉴定


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