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HSP70介导肾脏缺血预适应保护作用的实验研究

金欢胜  
【摘要】:缺血再灌注损伤导致的急性肾功能衰竭(Acute renal failure,ARF)发生率很高,最近有关缺血预适应(Ischemia Preconditioning,IP)预防缺血再灌注损伤的研究日益增多。器官短暂缺血/再灌注后能耐受更长时间缺血的现象称为IP。IP现象最先发现于心脏,以后发现肾脏也存在缺血预适应现象。缺血预适应的机制尚未完全清楚。文献报道,肾脏在缺血预适应后,热休克蛋白70(Heat shock proteins,HSP70)的表达升高,HSP70的高表达是否参与IP保护肾脏缺血再灌注损伤的机理,国内外未见报道。本课题拟运用腺相关病毒为真核表达载体制备含HSP70基因的重组腺相关病毒载体,进行体内外转染实验,证明HSP70在肾脏缺血预适应中是否介导保护作用。 目的:通过体内外转染实验研究AAV-HSP70基因转染介导肾小管上皮细胞抗氧化损伤的保护作用及在大鼠肾脏缺血再灌注损伤中介导的保护作用,探讨HSP70在肾脏缺血预适应中介导的保护作用机理。缺血预适应机制的深入研究对肾脏缺血再灌注损伤的防护及延长移植肾的存活时间有重要意义。 方法: 第一部分:AAV-HSP70的构建及表达 1. RT-PCR法从人肝癌细胞系HepG2中克隆HSP70基因,获得序列完全正确的全长HSP70cDNA。 2. 用已克隆的正确序列HSP70 基因片断, 构建腺相关病毒重组体pAAV-IRES-hrGFP/HSP70,将此质粒扩增、提纯后与pAAV-Helper、pAAV-RC 共转染AAV-293细胞,通过同源重组获得AAV-HSP70重组体,扩增后获得高滴度的AAV-HSP70病毒液。 第二部分:AAV-HSP70转染对肾小管上皮细胞抗氧化氧损伤的保护作用 将AAV-HSP70体外转染体外培养的肾小管上皮细胞,通过免疫组化法检测目的基因在转染细胞中的表达,通过MTT法及51Cr释放试验检测在不同浓度的H2O2作用下HSP70的保护作用。 第三部分:AAV-HSP70转染对大鼠缺血再灌注损伤保护作用的实验研究 1. 建立大鼠肾缺血再灌注损伤模型及缺血预适应模型,检测HSP70的表达;


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