人全长survivin基因修饰DCs疫苗的构建及其对乳腺癌作用的实验研究

【摘要】：研究背景: 乳腺癌是临床上常见的恶性肿瘤之一,采用传统的治疗方法尽管显示一定的治疗效果,但目前仍存在预后较差,生存率较低,如何改善其预后、提高生存率是目前临床上亟待解决的关键问题之一。近年来,由于树突状细胞(Dendritic ceils,DCs)具有体内强大的抗原递呈及免疫激发能力,因此针对DCs的生物治疗疫苗给乳腺癌的治疗带来了新的曙光。以往的DCs疫苗多采用乳腺癌细胞融合、乳腺癌细胞粗提抗原或乳腺癌相关蛋白多肽负载DCs等方法来构建,这些方法所能获得的乳腺癌抗原量较低,刺激DCs激发后续抗乳腺癌免疫应答能力较弱。为提高DCs抗原递呈及免疫激发能力,实现对乳腺癌更有效的生物治疗效应,针对人全长survivin基因在乳腺癌细胞中高表达,而在正常组织中未见表达,以人survivin抗原作靶抗原来刺激增强细胞毒T淋巴细胞免疫攻击能力,可以促进乳腺癌细胞凋亡,同时能避免自身免疫反应。本研究采用基因克隆及重组等技术,用重组腺病毒载体转染人全长Survivin基因修饰DCs,希望能促进DCs表面分子上调并且实现高效表达,加强其激活杀伤性T淋巴细胞增殖能力,实现强而有效的抗乳腺癌作用。同时,通过对所构建疫苗生物学特性及其对乳腺癌治疗作用的初步观察,希望能为乳腺癌DCs疫苗治疗提供新的思路和理论依据。 方法: 第一部分:人全长Survivin基因重组腺病毒载体构建及鉴定。首先采用DNA重组技术,将人全长survivin cDNA插入pAdTrack-CMV质粒中,构建穿梭质粒pAdTrack-survivin,经酶切、测序等方法鉴定目的基因连接成功后,再将此穿梭质粒转染到DH5α细菌中扩增;然后将该穿梭质粒与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转染BJ5183细胞,在其中通过同源重组构建重组人全长survivin-腺病毒载体(Ad-survivin),经酶切鉴定后在XL-Gold菌中扩增,提取质粒纯化并将其转入293细胞中包装、扩增病毒。细胞培养上清中检测出survivin mRNA表达。并通过浓缩离心、制备滴度高达1.65×10~8PFU/ml的病毒Ad-Survivin。