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187Q突变对人sTALL-2分子功能的影响

刘宝英  
【摘要】: TALL-2(TNF and apoptosis ligand-related leukocyte-expressed ligand 2,TNF和凋亡配体相关的白细胞表达配体2),又名APRIL(a proliferation inducing ligand,增殖诱导配体),是肿瘤坏死因子(TNF)超家族的新成员之一。属Ⅱ型跨膜蛋白,N端在胞内,C端在胞外,有膜结合型和可溶性两种活性形式。TALL-2在正常组织中几乎检测不到,但是在多种类型的恶性肿瘤细胞中却有高水平表达,并且可以在体内、体外促进这些恶性肿瘤细胞的生长。鉴于TALL-2与肿瘤细胞之间的密切关系,设法有效抑制TALL-2的功能活性,将可能为相关肿瘤的治疗提供崭新途径。研究表明TALL-2抗体和TALL-2的可溶性受体能够在一定程度上抑制TALL-2的功能,但是这两种策略都不涉及TALL-2分子本身的改变,因此我们想另辟蹊径,通过改造TALL-2分子构建能够与受体结合但是不能引发受体后效应的TALL-2突变体的方法,得到TALL-2的有效抑制剂。 在本课题组已成功克隆并表达了重组人可溶性TALL-2(soluble TALL-2,sTALL-2,编码105-250氨基酸序列)分子的基础上,借鉴Liu等人改建TALL-1 ( TNF and apoptosis ligand-related leukocyte-expressed ligand 1,又称BLyS或BAFF )分子的方法,在与TALL-1同源序列比对以及对TALL-2分子结构分析后,选择TALL-2第187位作为突变位点,借助一步反向PCR致突变法构建人sTALL-2第187Q的三个突变体,进而对sTALL-2突变体蛋白进行表达、纯化及生物学活性检测。取得的主要结果如下: 1.以pUC18/sTALL-2为模板,经一步反向PCR法构建了以编码丝氨酸的TCT、编码天冬氨酸的GAT和编码精氨酸的CGT替换sTALL-2第187位编码谷氨酰胺的CAA的三个突变体,分别命名为pUC18/msTALL-2-S、pUC18/msTALL-2-D和pUC18/msTALL-2-R。 2.将上述测序正确的突变型目的片段分别连接于原核表达质粒pQE-80L,构建了重组原核表达质粒pQE-80L/msTALL-2-S、pQE-80L/msTALL-2-D和pQE-80L/ msTALL-2-R。 3.将上述重组原核表达质粒分别转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导,均获得了较高水平的表达,并确立sTALL-2第187Q突变体msTALL-2-S、msTALL-2-D和msTALL-2-R在大肠杆菌中高效表达的最佳诱导表达条件均为终浓度1mmol/L的IPTG在37℃诱导表达4h。SDS-PAGE分析可见,各重组蛋白的大小均约为19kDa,主要是以包涵体的形式存在。Western blotting分析显示,各目的蛋白均在分子量约19kDa处出现单一条带。 4.经Ni2+-NTA纯化系统及尿素透析,各重组蛋白得到了有效纯化和复性。纯化蛋白在SDS-PAGE上呈现单一条带。经Sephadex G-75柱层析后得到各重组突变体的同源三聚体分子。 5.生物学活性分析显示,所制备的msTALL-2-S、msTALL-2-D和msTALL-2-R三种突变体蛋白均能与A549肺癌细胞及HepG2肝癌细胞上的受体结合,并且可以不同程度地阻断sTALL-2功能,抑制其对肿瘤细胞的增殖作用。 重组人可溶性TALL-2突变体的制备及功能研究,为研制新型TALL-2抑制分子创造了条件,同时有助于揭示TALL-2发挥作用的关键功能位点以及为深入阐明其作用机制提供新的有力证据,进而为TALL-2高表达相关的多种恶性肿瘤的治疗性研究奠定了一定基础。


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