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超声微泡介导转染FKBP12.6基因对小鼠H9c2(2-1)心肌细胞结构和功能的影响

刘国通  
【摘要】: 背景和目的: 研究发现,多种病理状态下的心肌细胞特征性地表现为兴奋-收缩耦联的诸多异常。其中,FK506结合蛋白12.6(FK506 Binding proteins 12.6,FKBP12.6)与细胞内Ca2+的释放和神经钙蛋白(Calcineurin,CaN)的活性密切相关,FKBP12.6的减少及其与肌浆网钙释放通道——2型雷尼丁受体(Ryanodine Receptor,RyR2)之间不协调的相互作用,是心肌细胞兴奋-收缩耦联障碍的重要原因,有可能作为治疗心肌功能异常的靶标。超声造影技术的不断发展和可携带基因的微泡声学造影剂的研制,使得超声已经从一种临床诊断工具,进入到治疗领域。超声波破坏含靶基因的微泡造影剂定位释放技术,是一种新型的基因定向转染技术,该技术使用的微泡直径小于8μm,含基因表达载体,微泡通过肺循环到达相应组织后,利用诊断超声增加特定组织的微血管通透性,使靶基因可通过微血管和内皮细胞间隙到达实质细胞内。国内外的研究结果表明,超声波破坏微泡可使基因的转染效率和表达明显提高。 本课题通过构建并扩增pcDNA3.1- FKBP12.6基因表达载体,以培养的小鼠心肌细胞为模型,从细胞到分子水平进行研究:应用诊断用超声微泡造影剂作为基因转移的载体,观察转染FKBP12.6基因后,对小鼠心肌细胞生长状况的影响,并观察FKBP12.6基因对小鼠心肌细胞结构和功能的干预效果。为在大体动物心力衰竭模型上进行基因治疗奠定基础,进而为探索安全、高效的治疗心肌功能异常提供新的途径。 方法: (一)pcDNA3.1- FKBP12.6基因表达载体的构建与扩增:目的基因全基因合成,PCR加入酶切位点,连接入pGEM-T-easy载体,经酶切鉴定及测序后获得测序正确的目的基因。连接入真核表达载体pcDNA3.1(-),再经酶切鉴定及测序后进行pcDNA3.1- FKBP12.6的扩增。 (二)实验研究:将pcDNA3.1-FKBP12.6质粒与白蛋白包裹微泡造影剂混合,经超声转染小鼠H9c2(2-1)心肌细胞后,通过倒置显微镜和透射电镜观察心肌细胞生长状况和超微结构的变化;激光共聚焦显微镜检测细胞内Ca2+浓度的变化;分别用RT-PCR、免疫组织化学、Western blotting方法检测mRNA、蛋白的表达。 结果: (一)pcDNA3.1- FKBP12.6基因表达载体的构建与扩增:成功构建并扩增pcDNA3.1- FKBP12.6基因表达载体。 (二)实验研究: 1.超声触发微泡破裂转染FKBP12.6基因的心肌细胞,细胞呈梭形排列,贴壁良好,细胞透亮,生长良好;内质网明显扩张,提示蛋白合成能力增强。 2.超声触发微泡破裂转染FKBP12.6基因可在心肌细胞高效表达。 3.高表达FKBP12.6的心肌细胞中,总的钙离子浓度增加,提示可能增强心肌细胞的收缩力。 结论: 通过超声触发微泡破裂转染FKBP12.6基因至小鼠H9c2(2-1)心肌细胞,我们得出以下结论: 1.超声触发微泡破裂转染FKBP12.6基因可在心肌细胞高效表达; 2.超声微泡介导FKBP12.6基因转染心肌细胞,可以明显改善心肌细胞的结构和功能,为今后探索安全、高效的心肌功能异常的治疗提供了新的思路。


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