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抗内毒素Fab’体内生物学效应的研究

马思远  
【摘要】: 烧伤后,包括粘膜机械屏障功能、肠道内固有菌群微生态屏障功能和肠道免疫屏障功能在内的肠道三大屏障功能均有不同程度下降,尤其是大面积较严重的烧伤病人往往会更加明显和突出。这些因素可以造成或者增加肠腔内细菌和内毒素(LPS)进入血液循环,爆发内毒素血症(intestinal endotoxemia,ITEM),造成全身炎症反应综合征(system inflammation response syndrome)、多器官功能失常综合征(multiple organdysfunction syndrome),甚至于死亡的后果。但是目前尚无特别有效的拮抗内毒素的药物应用于临床。对于感染的病例,抗生素的应用虽然能够有效控制细菌感染,但是却可能因为抗生素对细菌菌体的破坏作用反而促进了内毒素的释放,增加了内毒素血症的危险;器官支持和重症监护技术,以及抗炎性细胞因子(炎症介质)抗体或炎性细胞因子受体拮抗剂等技术和新药的使用也没有明显降低内毒素血症患者的病死率。 1893年,Klemper发现被免疫的产蛋鸡可以将其血清中的免疫球蛋白转运至蛋黄中;1969年Gerry Leslie和Bill Clem将该免疫球蛋白命名为卵黄免疫球蛋白(Immunoglobulin Y),简称IgY。免疫鸡蛋中含有大量来源于血清的卵黄免疫球蛋白,浓度远高于血清。卵黄抗体以产量高、制备工艺相对简单、成本较低以及良好的稳定性和特异性等优点逐步被人们所重视,国内外众多的研究也证明该免疫球蛋白对相应的抗原有较强的拮抗作用,因此IgY技术的研究和开发也获得了重要的进展和突破。目前,IgY技术已经在免疫学检测、预防和治疗细菌、真菌及病毒感染、肿瘤抑制等方面发挥着日益重要的作用。另外,据国外研究发现IgY在适宜的反应条件下可被胃蛋白酶消化、降解为Fab'和Fc片断,以及极少量的F(ab’)2和Fab片断,且Fab’片断仍然具有结合相应抗原和发挥拮抗效应等生物学活性的能力。本研究即将卵黄免疫球蛋白技术运用于拮抗内毒素血症的实验研究中,希望能从中探寻到一种既能有效拮抗LPS,又有较大临床应用价值的新药。 本研究用纯品LPS配合使用完全弗氏佐剂与不完全弗氏佐剂采用皮下注射和肌肉注射相结合的多点免疫法免疫罗曼鸡,分别采用改良水溶法(WD法)、硫酸氨分级沉淀法和胃蛋酶消化法从蛋黄液中制备、提取、纯化特异性抗内毒素Fab’,并对其产量、纯度、分子量和抗体效价等进行检测,结果显示抗内毒素Fab’的产量为4.2mg/mL蛋黄液,分子量为44KD,纯度为92%,效价为1:512 000;通过急性毒性实验,测定小鼠口服抗内毒素Fab’的LD_(50)大于7 500mg/kg体重,参照国际通用的外来化合物毒性六级分类评价标准进行急性毒性评价其属于第2级,即实际无毒级;使用本研究制备的抗内毒素Fab’口服治疗30%TBSAⅢ°烧伤的纯系昆明小鼠内毒素血症模型,结果显示抗内毒素Fab’能明显降低实验小鼠的死亡率;明显降低实验小鼠血浆中内毒素(LPS)、二胺氧化酶(DAO)、肿瘤坏死因子(TNF-a)和白细胞介素6(IL-6)的含量;回肠病理切片同样提示经抗内毒素Fab’口服治疗后,回肠粘膜的损伤程度明显减轻,该结果也表明了抗内毒素Fab'除了具有拮抗内毒素,减少其移位入血的作用外,还可以对回肠粘膜起到一定的保护作用。 根据本研究的实验结果,我们可以看出抗内毒素Fab’有较好的拮抗LPS作用,对小鼠烧伤后肠源性内毒素血症有较好的治疗作用,同时对肠粘膜也具有一定的保护作用。


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