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生物分子编码分析高通量定量检测技术的构建

蒋天伦  
【摘要】: 高通量检测技术和高通量筛选技术同为生物学研究的重要技术手段。高通量检测技术不仅可以大幅度提高生物学研究和实验诊断的检测效率,还可以大幅度提高从一个有限量标本中可以获得的信息丰度。但现有的高通量检测技术都还存在一定的不足,开发一种更优秀的高通量定量检测技术将弥补现有技术的不足,可以进一步促进生物学研究的发展和临床检测的进步。 在有关研究中,我们提出了生物分子编码分析(Biomolecules Coding Assay, BMCA)的构想,BMCA并不是针对某一种生物分子的专用检测方法,而是一种通用的生物分子检测与分析架构,只要靶分子(Target Biomolecules, TMs)存在能与之特异性结合的生物识别元件(Biomolecular Recognization Elements, BREs),就能够使用BMCA进行检测。其核心思想是,给不同TM的BRE标记不同的编码分子(Coding Molecules, CM),将其编码为分子性质各不相同的BRE-CM,并按一定浓度混合组成BMCA检测试剂,在BMCA检测试剂与待测标本反应之后用电泳等分离检测方法对反应混合物进行分析,由于不同BRE-CM以及反应中生成的TM-BRE-CM具有各不相同的分子性质,能够彼此分离并被定量检测,根据反应后某些BRE-CM的消耗量,可以准确计算出相应TM在待测标本中的浓度,所以,进行1次BMCA测试,就可以测出标本中所有TM的浓度。 围绕BMCA的实施方案、定量分析方法和检测范围,本课题总共进行了生物分子编码分析最小系统模型、生物分子编码分析定量模式、生物分子编码分析检测蛋白质模型和生物分子编码分析检测核酸模型等四部分实验研究和探索,可以得到如下研究结果和结论: 1.生物分子编码分析的技术原理和一般步骤 研究实现了BMCA的最初构想,即利用分子标记的方法,使分子性质相近或相同的BRE,被转变成能够被某一种方法分离并单独测定其含量的BRE-CM,由针对多种TM的BRE-CM组成的BMCA检测试剂在与检测标本进行反应之后,TM与BRE-CM结合形成的TM-BRE-CM与BRE-CM具有不同的分子性质,使相应BRE-CM的一部分被分离或消耗,导致相应BRE-CM浓度的降低,反过来,根据相应BRE-CM浓度的消耗,可以计算出相应TM在检测标本中的浓度。 一个完整的BMCA检测包含以下步骤: (1)确定要检测的TMs。 (2)制备检测试剂,检测试剂中除了所有TMs相应的BRE-CM(test BRE-CM, tBRE-CM)之外,还应该包含至少1种不与BMCA分析系统中任何组分发生结合反应的BRE-CM用作参考BRE-CM(reference BRE-CM, rBRE-CM)。 (3)将检测试剂、检测标本和一些必要的缓冲液混合后保温一定时间,如果标本中含有某些TM,将与其相应的BRE-CM形成TM-BRE-CM复合分子,同时其相应的BRE-CM被消耗。 (4)使用色谱或电泳等组分分离检测方法对标本与检测试剂的混合物进行组分分析,检测其中各种BRE-CM和TM-BRE-CM的含量。 (5)根据检测反应中各tBRE-CM的浓度的消耗,来计算相应TM在标本中的浓度。 2.生物分子编码分析的定量方法 在BMCA中一种TM会引起两种可以检测到的信号:TM-BRE-CM条带的形成和tBRE-CM条带的减少。由于BMCA分离检测时加样误差的影响,使得直接测定tBRE-CM消耗量变得比较困难,为此,我们在检测试剂中引入了rBRE-CM,利用tBRE-CM与rBRE-CM的浓度的比值的变化来间接反映tBRE-CM的消耗量,并据此推导出了BMCA的定量分析方法。 (1) BMCA的定量检测的相关公式 使用tBRE-CM与rBRE-CM浓度的比值的降低值△R作为变量,BMCA的定量分析公式为: 最低检出限Cmin计算公式为: 最高检测限Cmax的计算公式为: 公式的详细推导过程见第二部分研究。 (2) BMCA定量分析方法 当△R≤3×SD_(△R)时,TM的浓度C_(TM)≤C_(min);当3×SD_(△R)△RR_R时,TM的浓度用公式(2)进行计算;当△R=R_R时,C_(TM)≥C_(max)。 3.dsDNA是理想的BMCA编码分子 理论上,dsDNA的分子量可以以660Da(1bp dsDNA的分子量)为步长无限增长,可以提供足够的分子量多态性。此外dsDNA还具有如下特点:(1)能够与BRE偶联且不影响BRE与TM结合的特异性和结合效率。(2)具有足够的稳定性,dsDNA相较于RNA具有很强的稳定性,对核酸酶的攻击相对不敏感。dsDNA相对于蛋白质来说具有好得多的热稳定性,且不易水解。(3)dsDNA本身就是一种报告分子,可以在电泳中用核酸染料直接显示并被定量测定。(4)虽然dsDNA的高级结构和某些特殊序列给BMCA带来非特异性响应,但是通过给dsDNA预先嵌入核酸染料的方法或者去除那些可能造成干扰的特殊序列等方法,完全可以消除这种负面效应。因此,dsDNA不失为理想的BMCA编码分子。 4.BMCA的方法学特性 (1)灵敏度 由公式4可以看出,BMCA的最低检出限与检测试剂中rBRE-CM的浓度和标本空白的标准差SDΔR成正比。说明降低rBRE-CM的浓度和SDΔR的值有利于提高BMCA的灵敏度,这在第三部分实验中得到了充分的证实。 虽然降低rBRE-CM的浓度可以提高BMCA的灵敏度,但rBRE-CM的浓度不能低于所用检测方法的最低检出限,同时, SDΔR反应的是所用分离检测方法重复性,因此,可以认为BMCA的灵敏度与所用检测方法的灵敏度和重复性相关。只要这种方法的重复性足够好, SDΔR可能是小于1的数字,因此BMCA的实际检出限可以低于所用检测方法的最低检出限。目前电泳检测和色谱分析的最低检测限都可以达到10-11g,据此推测BMCA的灵敏度至少可以达到这一水平,甚至更好。 (2)特异性 BMCA是一种通用的生物分子检测架构,其特异性主要由TM与其BRE结合的特异性来决定。此外,BMCA是为数不多的可以对1种检测物质产生2种信号的检测方法,这就提供了一种自身约束机制,可以从一定程度上增加BMCA的特异性。 (3)检测通量 BMCA的检测通量由CM的分子多态性和所用分离检测方法对这种多态性的识别能力共同决定。如果采用dsDNA作为CM,其分子量能以约660 Da (1bp dsDNA的分子量)为步长无限增加,因此,理论上BMCA的检测通量是无限的。但实际上,在给定的电泳中,所能检测的dsDNA的分子量大小是有一定范围的,例如本研究所使用的安捷伦DNA 1000型电泳芯片,就只能检测15-1500bp的dsDNA,因此BMCA的检测通量是有限的,只不过其检测上限可以随着检测方法的改进能而提高。即使如此,BMCA的检测通量也远远高于xMAP的100种限制。 5.BMCA是通用的生物分子高通量检测技术 在客体研究中,用BMCA成功实现了亲和素与细菌16S RNA基因PCR片段的检测,说明只要TM存在能与之特异性结合的BRE,就能够使用BMCA进行检测。因此,BMCA并不是针对某一种生物分子的专用检测方法,而是一种生物分子通用的检测与分析架构。 由于电泳、色谱等分离检测方法只需要一次测试就可以分离检测出BMCA检测试剂与标本的混合物中所有的BRE-CM,因此只需要1次BMCA实验,就可以测得待测标本中多种TM的含量。因此,BMCA是一种生物分子通用的高通量定量检测技术。 6.BMCA的影响因素 当检测标本中出现与CM相同化学性质的组分,如采用dsDNA作为CM来检测核酸时,如果采用针对CM化学性质的检测方法来检测BRE-CM,检测标本中化学性质类似的组分就会给BMCA带来严重的干扰。 为此,我们设想在CM上标记另一种报告分子,例如在dsDNA上标记荧光分子,以此作为BRE-CM的识别信号,不仅可以消除检测标本中与CM化学性质类似的组分给BMCA带来的干扰,还相当于给CM引入一种二维的分子性质差异,有可能进一步提高BMCA的灵敏度与检测通量。 总之,经过本项目的研究,初步建立了一种生物分子通用的高通量定量检测技术,解决了现有高通量检测方法中高通量与定量检测不能兼顾的问题,可望成为高通量检测技术研究的一个新起点。利用这一技术,可以对检测标本中的蛋白质、核酸甚至是细胞表面标志物进行高通量定量检测,是生物学研究、实验诊断、食品卫生检验、环境监测甚至法医学检验的有力工具。


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