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核苷类似物治疗慢性乙型肝炎病毒准种演变与临床关系的研究

刘霖  
【摘要】: 慢性乙型肝炎威胁全球人类健康,其中1/3以上的慢性感染者在中国。抗病毒治疗是慢性乙型肝炎的核心治疗措施。核苷类似物是目前抗病毒治疗的主流药物,随着众多新型核苷类似物的研发和逐渐上市,临床用药有了更多选择。其中恩替卡韦(ETV)作为强效HBV抑制药物已于近年上市,但目前尚缺乏对ETV长期治疗的临床观察,及其与现有的主流核苷类似物如拉米夫定(LAM)长期疗效对比的对照研究。 同时,这些核苷类似物在使用过程中遇到一系列难以回答的问题,诸如:①初治患者应如何选择核苷类抗病毒药物;②核苷类似物耐药的预防和处理;③核苷类似物可否联合、序贯使用,如何使用;④停药时机的把握等。我们注意到,核苷类似物的耐药问题是上述问题的核心。目前核苷类似物的使用也主要把握两点:一是充分发挥药物的抗病毒功效,另一方面则是尽量避免耐药的发生。然而目前临床使用核苷类抗病毒药物缺乏必要的实验室依据,同时对治疗过程中病毒变异的分子病毒学过程和耐药发生机制缺乏深入的了解,这是制约核苷类似物科学合理使用的关键问题。 准种概念的引入为我们客观认识高变异病毒在宿主免疫和药物等压力下的运动规律提供了新的切入点。对HCV、HIV等高变异病毒的准种研究发现,这些病毒以种群选择优势对抗环境压力的改变,使种群得以延续。它们在宿主体内以多变异株的形式混合存在,在一定的外界压力下以某一或某些对当前压力具有选择优势的变异株为优势准种,且准种群可随着外界压力的改变而发生演变以进一步适应环境。最近的研究发现,HBV种群在核苷类似物治疗过程中也可发生类似演变,且与HBV耐药和抗病毒治疗失败密切相关。但由于均为个案研究,虽然为进一步的研究提供了线索,但仍对这一问题缺乏系统深入的理解。同时,目前的研究方法仍以“PCR-克隆-测序”为“金标准”,尚缺乏对HBV准种进行精确、简便检测和筛选的研究方法。 为探讨上述问题,本研究选择了36例接受ETV或LAM治疗的慢性乙型肝炎患者进行了长达192周的随访观察,其中17例LAM初治患者有14例接受了后续ETV序贯治疗。我们对不同药物治疗的两组患者的血清HBV DNA和ALT水平进行了动态监测,以比较两种药物对病毒抑制和肝功能恢复的疗效。我们保留了全部血清样本共200余份,并全部进行了“PCR-直接测序”,以了解耐药发生情况,并比较两种药物的耐药发生率。我们进一步采用国际认可的“金标准”“PCR-克隆-测序-序列分析”的方法,对6例发生临床病毒学突破的患者以及4例未发生临床病毒学突破的患者(阴性对照)的全程血清样本进行了准种检测,共测序2100余个,以系统深入地对LAM和ETV治疗过程中HBV种群的演变及其临床意义进行探讨。最后,我们建立了适合于检测包含所有目前已知的核苷类似物耐药突变位点的P区目的片段准种的研究方法,并对准种检测的方法学问题进行了讨论。 主要结果: 一、ETV和LAM对HBV DNA的抑制效果的中、长期比较:治疗1年时ETV较LAM为佳(t=2.570, P=0.0180.05),而延长疗程两组无统计学差异(t60=1.570, P60=0.148; t72=1.432, P72=0.190; t96=1.663, P96=0.137)。ETV和LAM对肝功能改善的中、长期疗效无统计学差异。尚须扩大样本量以确证这些研究结果。 二、ETV和LAM治疗96周耐药发生率比较:ETV显著低于LAM(Pearsonχ2=6.490, P=0.0160.05)。 三、ETV初治患者和LAM预治疗患者使用ETV后的耐药发生率,初治患者显著低于后者(Pearsonχ2=8.291, P=0.0360.05)。 四、发生临床病毒学突破患者体内的HBV准种群发生了复杂而有规律的演变,未发生病毒学突破的患者体内HBV准种群则保持比较稳定的状态。耐药毒株总是以劣势株被药物压力筛选出来,并在准种群中逐渐累积,最终代替原有优势准种,并伴随临床病毒学突破和抗病毒治疗的失败。 五、体内检出耐药毒株的患者均发生了临床病毒学突破,而发生病毒学突破的患者则未必伴随耐药毒株的产生。 六、发现在HBV准种群中曾经出现的优势准种在药物压力改变后可以劣势准种存在于准种群中,并可进一步演变为多核苷类似物耐药毒株。 七、发现了未曾报道过的rtV190A耐ETV突变,该突变与已知的几个突变联合出现成为ETV治疗过程中导致病毒学突破的耐药突变株rtM204V/L180M/T184L/V190A。 八、发现LAM治疗可在患者体内筛选出rtM204V/L180M联合突变株,这一突变株在LAM药物压力下较rtM204I突变株或rtM204I/L180M联合突变株具有更强的复制能力和选择优势,因此rtM204V/L180M联合突变株和rtM204I或rtM204I/L180M联合突变株的混合感染在发生病毒学突破时的优势株均为前者,我们称其为“VM突破”。 九、LAM治疗可在HBV准种群中逐渐筛选出rtM204I/V突变、并可进一步演变为具有更高复制能力的rtM204V/L180M联合突变,这一联合突变株能在ETV治疗过程中可以劣势准种的形式“记忆”于准种群中,并可进一步演变为rtM204V/L180M/S202G、rtM204V/L180M/T184L、rtM204V/L180M/T184L/V190A等ETV耐药联合突变,因此,LAM-ETV序贯治疗可分级攻克ETV具备的“基因屏障”,我们称之为LAM-ETV序贯治疗的“阶梯效应”。 十、发现在发生临床病毒学突破12~72周前即可在患者体内检出以劣势准种存在的耐药毒株,耐药毒株在准种群中的累积并替换原因野生型毒株需要一定的时间,这为我们进行临床准种监测提供了可行性。 十一、60个克隆测序后将测序结果随机分为10、15、20……55个克隆共10组,χ2检验发现对于优势准种的反映检测15个克隆以上(χ2=2.700,P=0.1000.05),对劣势株的检出检测30个以上则与检测60个克隆无统计学差异(χ2=2.411,P=0.1200.05);比较8个样本共270个克隆的CSGE及测序结果,两者表现出良好的对应性(准确率达98.9%)。 通过对这些结果进行分析并和既往研究结果进行比较,结论如下: 一、ETV治疗慢性乙型肝炎的耐药发生率显著低于LAM,长期治疗更加安全; 二、HBV对核苷类似物耐药的机制为:耐药毒株在准种群中被药物压力筛选、比例逐步升高并逐渐成为优势准种,导致准种群整体表现出对药物的耐受性; 三、存在尚未报道的核苷类似物耐药突变,这些突变可能存在于HBV基因组P基因rt区的B、C、D、E区域之外,并可与已知的耐药突变联合出现导致病毒耐药或增强其耐药能力。 四、LAM-ETV序贯治疗可导致ETV的“基因屏障”失效,因此初治宜选用强效病毒抑制药物如ETV,而不宜使用耐药发生率高的药物; 五、rtM204V/L180M联合突变极易进化为ETV耐药突变,因此一旦在准种群中检出该突变,即不推荐使用ETV治疗; 六、核苷类似物耐药HBV准种在病毒学突破前12~36周即可被检出,因此有必要在临床开展HBV准种检测并建立常规的实验室检测方法,在抗病毒治疗过程中至少每3个月须作一次准种检测和准种组成分析; 七、准种检测一旦发现耐药准种累积,须立即换用其它敏感药物; 八、用“PCR-克隆-CSGE或SSCP/HDA-测序”的方法视不同需求检测15或30个克隆可准确反映1份血清样本中HBV准种的组成和分布。


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