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骨髓来源的间充质干细胞靶向治疗脑胶质瘤的实验研究

杨丽平  
【摘要】: 研究背景:脑胶质瘤是中枢神经系统常见的肿瘤之一。因肿瘤细胞早期就有向周围正常组织浸润生长的特性,是胶质瘤难以治疗及容易复发的根源。虽然临床应用手术、放疗、化疗等多种治疗手段,患者的生存期并没有得到明显改善。能够准确发现肿瘤的微卫星灶,并将治疗药物靶向作用于肿瘤部位,是治疗肿瘤的直接而有效的途径,也成为目前众多研究人员所致力解决的课题之一。 近来研究发现干细胞具有向肿瘤定向迁移的特性。利用干细胞为载体携带治疗基因或药物靶向治疗肿瘤可能是肿瘤治疗的新突破。骨髓来源的间充质干细胞具有在不同的诱导条件下向中胚层组织细胞分化的能力,而且取材方便,体外分离与增殖技术成熟等特点,在干细胞移植和基因治疗中颇受青睐。 因此我们首先建立稳定可靠的动物胶质瘤模型用以研究胶质瘤的生长特征,同时分离大鼠的骨髓间充质干细胞,并应用立体定向的方法给胶质瘤大鼠接种MSCs细胞,通过活体动物检测仪、细胞的体外增殖分析、免疫组化等方法观察MSCs细胞在体内及体外的迁移趋化特性及对肿瘤生长的影响。 第一部分构建稳定表达萤火虫荧光素酶或海肾荧光素酶的9Lluc或MSCRL细胞 首先通过酶切的方法获得表达萤火虫和海肾荧光素酶(F-luc和R-luc)的目的基因片段,将其连接到慢病毒表达质粒pBPLV,构建慢病毒表达载体pBPLV-PGL3及pBPLV-RL,通过PCR,酶切或DNA序列测定方法证实克隆的目的基因序列完全正确后,将慢病毒表达载体通过脂质体转染到9L胶质瘤细胞或骨髓间充质干细胞,应用无菌流式细胞分选仪分选出稳定表达萤火虫荧光素酶的9Lluc细胞或海肾荧光素酶的MSCRL细胞,并扩增培养。将9Lluc或MSCRL细胞梯度稀释于96孔板中,分别加入萤火虫荧光素酶底物D-luciferin或海肾荧光素酶检测试剂,2-5min后放入暗箱中检测。结果发现9Lluc/MSCRL细胞所释放的光子量均与细胞数量呈正相关,表明萤火虫荧光素酶或海肾荧光素酶已稳定转染入9L或MSC细胞。 第二部分9L/Wistar脑胶质瘤模型的构建及9L在Wistar大鼠及F344大鼠生长特性的对比观察 取对数生长期的9Lluc细胞,消化、离心,并进行细胞记数,调整为终浓度1×10~5/μl,并将DAPI与细胞充分混匀。取成年雄性Wistar大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后,于前囟中点后1.0 mm,矢状缝右旁开3.0mm用小型牙科钻钻孔。抽取1×10~6 DAPI标记的9Lluc胶质瘤细胞悬液,经颅孔垂直于颅骨外板进针5mm,以1μl/min的速度缓慢推注,手术过程均无菌操作。对照组动物注射等量的PBS。于细胞移植后0天,7天,14天,21天,分别给予腹腔注射萤火虫荧光素酶底物D-luciferin (150mg/kg),将动物置于活体动物检测仪密闭的暗箱中成像观察肿瘤的生长状况。检测结束后,将动物脱颈处死,断头取脑。以注射部位为中心切取脑组织,HE常规染色,光镜下观察形态学变化并做GFAP和Vemintin的免疫组织化学染色观察阳性物质的分布特点。 结果发现细胞移植后7天所有动物均可检测到肿瘤发生,7天至21天肿瘤逐渐增大,光子量明显增强。组织病理学观察发现脑立体定位术后大鼠颅内成瘤率100%,低倍镜下可见肿瘤类似球形,与周围脑实质边界较清楚,瘤内可见出血,瘤周有肿瘤细胞浸润,瘤周及瘤内新生血管丰富。高倍镜下肿瘤细胞形态多样,核大,多核,核质深染,核异形性高。而免疫组织化学检测未发现肿瘤细胞GFAP或Vemintin染色阳性,而肿瘤细胞间胶质网可见阳性染色。结合HE染色的形态学改变,符合低分化的恶性胶质瘤的特征,表明9L/Wistar大鼠脑胶质瘤模型构建成功。 我们随之比较9L胶质瘤细胞在Wistar大鼠及F344大鼠的生长特性 采用立体定向手术,在Wistar大鼠或F344大鼠右侧尾状核接种1×10~5的9Lluc细胞,分别于接种后7,14,21天通过活体动物体内成像系统检测肿瘤的生长情况,并于检测结束后断头取材,观察肿瘤的形态学变化,采用免疫组化的方法检测肿瘤细胞GFAP,Vemintin的表达,及大鼠脑内淋巴细胞浸润情况。 结果发现Wistar大鼠或F344大鼠颅内接种9Lluc细胞后成瘤率100%,肿瘤组织病理学均具有恶性胶质瘤的特点;BLI检测发现9Lluc /F344胶质瘤逐渐增大,而Wistar大鼠在接种同等数量的9Lluc胶质瘤细胞后仅于第7天可检测到肿瘤生长,之后即消失,而且在肿瘤局部可见大量CD4,CD8阳性淋巴细胞浸润;而在9Lluc /F344模型中未见CD4、CD8阳性细胞。 第三部分:骨髓间充质干细胞向肿瘤的趋化研究 取生长状态良好的9L细胞培养48h,收上清。在24孔板的中加入无血清的9L上清600μl,将Transwells憩室没入其中,将体外培养的F344大鼠MSCs消化离心,每个Transwells板中加入2×10~5cells,继续培养24小时。光镜下观察结果,随机选取5个视野计数,观察MSC细胞的体外迁移情况。 同时取对数生长期的9L细胞,标记PKH26染料,进行细胞计数,使其终浓度为2×10~4/μl,通过立体定向方法于裸鼠的颅内接种标记PKH26的9L细胞(1×10~5)。接种细胞后7天,再次通过立体定向方法于胶质瘤裸鼠对侧脑实质接种MSCRL细胞(1×106),接种位置为前囟中点后1.0mm,矢状缝左旁开3.0mm。对照组为未接种胶质瘤细胞,仅接种同等量的MSCRL细胞。整个实验均在无菌条件下操作。于接种MSCRL后0,7,14天分别于活体动物检测仪中观察MSCRL细胞的迁移情况,并于预定时间将动物脱颈处死后取脑组织做冰冻切片,荧光下观察细胞的迁移情况。 结果发现MSCs在体外无自发迁移的特性,而在Transwell板底层的小室中加入9L细胞的条件培养基时,MSCs细胞发生迁移,且迁移能力与9L细胞的数目呈正相关。通过活体动物体内成像同样观察到胶质瘤裸鼠接种MSCRL细胞后0天多集中于注射部位,而第7天时,可发现MSCRL细胞向中线迁移,原注射部位细胞减少,光子量减低;注射后第14天,可见部分细胞已迁移到原注射部位对侧,即肿瘤侧。而未接种胶质瘤细胞的动物MSCRL细胞则多位于注射原部位,未发生迁移。动物检测结束后,脱颈处死,将脑组织冰冻切片荧光显微镜下可观测到携带有绿色荧光蛋白的MSCs迁移到肿瘤组织周围,在肿瘤与正常脑组织的边界分布较多。 第四部分:骨髓间充质干细胞对肿瘤生长作用的实验研究 首先观察体外MSCs对胶质瘤细胞增殖的影响。在6孔细胞培养板中,接种9Lluc大鼠胶质瘤细胞,1.3×10~5/孔进行单独培养或应用9Lluc大鼠胶质瘤细胞及MSCs或HEK细胞的条件培养基培养3天。在普通显微镜下计各孔细胞总数,荧光显微镜下计9Lluc细胞数,然后胰蛋白酶消化细胞,应用流式细胞仪分别计数各孔荧光细胞数。 在体观察MSCs对肿瘤生长的影响,在F344大鼠颅内接种9Lluc细胞后7天,通过立体定向方法分别于胶质瘤大鼠肿瘤原位(即前囟中点后1.0mm,矢状缝右旁开3.0mm,深度为4mm)、同侧脑室(前囟中点后3.0mm,矢状缝右旁开1.0mm,深度为2mm)、对侧脑实质(前囟中点后1.0mm,矢状缝左旁开3.0mm,深度为4mm)及股静脉接种MSCs细胞。于接种MSCs细胞后0,7,14天通过BLI在体观察MSCs对胶质瘤生长的影响。检测结束后,灌注固定,以注射部位为中心切取脑组织,行HE常规染色和CD4、CD8的免疫组化染色,于光镜下观察形态学变化及大鼠脑内CD4,CD8淋巴细胞浸润情况。 我们通过将9Lluc与MSCs或HEK细胞共培养后,发现9Lluc细胞单独培养3天后,流式细胞仪检测9Lluc细胞数为1.0925±0.068×10~6;与HEK细胞共培养3天后,9Lluc细胞数为1.97±0.150×10~6;而与MSCs细胞共培养3天后,9Lluc细胞数为0.14±0.016×10~6,表明胶质瘤细胞的生长受到明显抑制(P0.01)。在体研究同样观察到MSCs抑制胶质瘤的生长。将F344大鼠颅内接种9Lluc细胞7天后,采用不同方式移植MSCs细胞,细胞移植后0,7,14天通过BLI检测观察肿瘤的生长情况。MSCs细胞移植当时检测各组动物肿瘤的生长基本均衡;于MSCs移植后7天,与对照组相比,接受MSCs治疗的动物胶质瘤的生长速度有所增快,但移植后14天肿瘤却比第7天明显缩小,部分动物肿瘤甚至检测不到。同时我们采用免疫组织化学的方法观察到在未接受MSCs治疗的9Lluc/F344胶质瘤大鼠中未见CD4、CD8阳性细胞;而在给予MSCs治疗的胶质瘤大鼠,肿瘤组织内CD4,CD8阳性淋巴细胞多见,浸润明显。 结论:我们通过制造大鼠的脑胶质瘤模型并观察MSCs在体及离体对肿瘤的迁移及对肿瘤生长的作用发现MSCs细胞可以向胶质瘤迁移,并抑制肿瘤的生长,其作用的发挥可能是通过调动机体的免疫细胞或自身分泌的细胞因子有关,尚有待进一步研究。


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