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牛蒡子苷分离、纯化及其对实验性糖尿病大鼠血管内皮细胞保护机制的初步探讨

卢来春  
【摘要】: 目的:研究牛蒡子的化学成分,分离纯化牛蒡子苷,并初步探讨牛蒡子苷对实验性糖尿病大鼠血管内皮细胞损伤的保护机制。 方法:(1)采用硅胶柱层析、聚酰胺层析、LH-20等方法对牛蒡子的化学成分进行研究;(2)采用正交实验设计方法,以牛蒡子苷为指标,确定了牛蒡子乙醇回流提取的最佳工艺;对10种类型大孔吸附树脂进行筛选,筛选出对牛蒡子苷吸附效果最佳的树脂;采用硅胶柱层析法,对牛蒡子苷进一步分离纯化;(3)建立实验性糖尿病大鼠模型,以GLU、TC、TG、HDL-ch、LDL-ch、TB、ALB、BUN、CREA、GHbAlc、NO、SOD、ET、MDA和尿液中TB、ALB为指标,研究牛蒡子苷药理活性;(4)以差速消化法纯化Wistar大鼠的主动脉内皮细胞(RAECs)并进行传代培养,测定牛蒡子苷对高糖条件下RAECs活性、RAECs释放LDH、MDA和NO的变化以及RAECs表达内皮型一氧化氮合酶(eNOS)表达的影响。 结果:(1)对牛蒡子的化学成分进行研究,共分得12个单体化合物,并应用光谱法(1H-NMR、13C-NMR、DEPT),确定了全部12个化合物的结构,分别为牛蒡子苷元(arctigenin,1)、罗汉松脂素(matairesinol,2)、牛蒡酚B(lappaol B,3)、牛蒡酚A(lappaol A,4)、牛蒡酚F(lappaol F,5)、牛蒡子苷(arctiin,6)、8-羟基松脂素(8-hydroxypinoresinol,7)、(+)-秦皮树脂醇( (+)-Fraxiresinol,8)、无梗五加苷B(acanthoside B,9)、山萘酚(kaempferol,10)、槲皮素(quercetin,11)和异槲皮素(isoquercitrin,12);(2)采用正交实验设计方法,以牛蒡子苷为指标,确定了牛蒡子乙醇回流提取的最佳工艺为乙醇浓度70%,回流3次,回流时间1h,加8倍溶剂量。其次,以牛蒡子苷为指标,HPLC检测,通过对大孔吸附树脂进行静态和动态的吸附-洗脱实验,系统筛选了10种大孔吸附树脂,筛选出最佳树脂为AB-8型大孔吸附树脂;并对最佳树脂吸附-洗脱牛蒡子醇提液的工艺进行了实验研究,确定了分离富集工艺为:上样药液浓度控制为5.5mg/mL,上样流速控制为2BV/h,柱径高比控制为1:5,水洗3倍树脂体积,水洗速度1BV/h;再换以4BV50%乙醇洗脱,醇洗速度2BV/ h,收集50%醇洗液,浓缩干燥即得。经过AB-8型大孔吸附树脂处理后,牛蒡子苷固含量达到50%以上,最后,采用硅胶柱层析法,氯仿:甲醇(9:1)洗脱进行纯化,经HPLC检测,牛蒡子苷的含量达到90%以上;(3)牛蒡子苷各剂量组对实验性糖尿病大鼠血液中GLU、GHbAlc浓度影响不显著,牛蒡子苷醇提物组能降低GLU、GHbAlc浓度;牛蒡子苷各剂量组及其醇提物组均能降低实验性糖尿病大鼠血液中的TC、TG、LDL-ch、ALB、BUN、CREA、ET、MDA水平,降低糖尿病大鼠尿总蛋白、尿白蛋白排泄量;同时,升高糖尿病大鼠血液中的HDL-ch、NO、SOD水平;(4)牛蒡子苷在低剂量组时,对内皮细胞生长无影响,随着药物浓度升高,牛蒡子苷对内皮细胞有一定抑制作用,且有一定剂量依赖性;在一定浓度下(1μg·ml-1、10μg·ml-1及100μg·ml-1)下,牛蒡子苷呈剂量依赖性的显著减少高糖诱导的LDH、ET和MDA释放;显著增加高糖条件下内皮细胞分泌NO的能力;增加高糖条件下内皮细胞eNOS的表达。 结论:(1)牛蒡子的醇提物部分主要是木脂素类化学成分,其中牛蒡苷含量最高;(2)建立了牛蒡子苷的分离、纯化方法,此方法简便,稳定,可应用于生产;起草了牛蒡子苷的质量标准(草案)。(3)牛蒡子苷降血糖作用不明显,但可以通过调节实验性糖尿病大鼠的脂类、蛋白的代谢,对糖尿病血管并发症有一定疗效,通过促进一氧化氮合酶的表达而对内皮细胞起保护作用。


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