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缺氧早期心肌细胞微管损伤与线粒体损害的关系研究

邝勇  
【摘要】: 缺氧是严重烧伤、创伤及其他多种疾病最常见的病理现象之一,缺氧导致的能量代谢障碍是引起细胞和组织器官损害的根本原因。然而,长期以来人们对缺氧条件下线粒体损害及能量代谢障碍的确切机制并不完全清楚,临床上亦缺乏有效的调理措施。近年来研究表明,微管与线粒体之间存在密切的联系,微管除了对线粒体胞内定位及分布起一定作用外,更重要的是微管还可能了参与了线粒体呼吸功能的调节过程。这一观点的证实将有助于为揭示缺氧细胞能量代谢障碍的发生机制与调控环节提供新的切入点,为防治缺氧损害提供新的理论依据与思路,具有重要的理论意义与临床指导价值。为证实这一推测,我们观察了缺氧早期不同时相点的微管及线粒体变化情况,并利用特异性微管解聚剂研究了微管损伤情况下线粒体相关变化。 一、材料与方法 1.原代培养wistar大鼠乳鼠心肌细胞,制备缺氧模型。 2.在缺氧后10、20、30、60min 4个不同时相点,利用扫描电镜观察微管的形态结构;采用激光共聚焦显微镜观察微管的分布,并计算微管的荧光强度;应用Western- Blot检测微管蛋白α亚基的表达量改变,研究缺氧早期心肌细胞微管损害的时效对应性。 3.在缺氧后10、20、30、60min 4个不同时相点,利用透射电镜观察线粒体的形态结构;采用激光共聚焦显微镜观察线粒体的分布,并计算线粒体的荧光强度;应用生物耗氧呼吸仪检测心肌细胞的呼吸控制率;应用高效液相色谱仪检测心肌细胞ATP含量,研究缺氧早期心肌细胞线粒体损害情况。 4.以秋水仙素解聚微管,建立微管解聚模型。 5.在解聚微管并缺氧后10、20、30、60min 4个不同时相点,观测缺氧心肌细胞线粒体的形态、分布、呼吸控制率和ATP含量,与缺氧组进行比较,分析微管损害在线粒体损害中的作用。 6.统计学处理所有数据以均数±标准差( x±s)表示,采用SPSS10.0统计学软件进行t检验。以P0.05和P0.01分别表示相差显著和非常显著。 二、主要结果 1.缺氧后10min,心肌细胞微管的念珠状结构即消失,微管蛋白荧光强度降低,微管蛋白α亚基表达量增加;缺氧20min后,微管结构性破坏加重,至1h出现微管分布规律性丧失,微管蛋白荧光强度进一步降低,微管蛋白α亚基表达量进一步增加。 2.缺氧后10min,线粒体未见明显形态改变。缺氧20min后,线粒体出现浓缩,不同程度肿胀,嵴模糊甚至溶解,空泡化,胞浆内有聚集的糖原致密颗粒(提示储积的糖原不能及时转化为能量,线粒体功能受损)等明显形态和结构改变,且随缺氧时间延长而加重。线粒体功能也出现相应改变。缺氧10min,心肌细胞RCR较正常组显著降低,但ATP含量变化不明显;缺氧20 min、30min和1h,随缺氧时间延长,各组RCR和ATP含量较正常组进一步显著下降。线粒体活性染色表明,缺氧1h内线粒体的染色活性并未受到严重影响。提示缺氧情况下,微管损害略早于线粒体结构与功能损害。 3.单纯微管解聚即可使线粒体RCR和ATP显著降低;缺氧20min、30min、1h后,缺氧解聚组线粒体分布规律性及形态结构损害均较单纯较缺氧组加重;缺氧20min、30min、1h后,缺氧解聚组心肌细胞RCR、胞浆ATP含量显著低于单纯缺氧组(P值均 0.01)。 三、结论 1.心肌细胞缺氧后10min即可出现微管解聚,提示微管损伤是缺氧心肌细胞损伤的早期事件,且随缺氧时间的延长而加重。 2.缺氧20min后,线粒体先出现RCR和ATP下降等功能性损害,随后出现明显的分布和结构损害,提示缺氧情况下,微管损害略早于线粒体结构与功能损害。 3.缺氧情况下使用微管解聚剂,可显著加重缺氧心肌细胞线粒体分布紊乱和形态结构损害,以及线粒体呼吸功能和能量代谢障碍,提示缺氧情况下较早发生的微管损害在线粒体损害中起一定作用。 4.本研究的结果在一定程度上为提出“微管参与线粒体呼吸功能和能量代谢调节”的理论假设提供了依据。


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