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大肠杆菌双杂交筛选AMPKα2相互作用蛋白

符庆瑛  
【摘要】: AMP激活的蛋白激酶(AMPK)是真核生物中广泛存在的一种蛋白激酶,主要协调代谢和能量的需要。一旦被激活,即可磷酸化下游靶蛋白,一方面关闭消耗ATP的合成代谢途径,另一方面开启产生ATP的分解代谢途径,被称为“细胞能量调节器”。AMPK除了通过调节参与糖、脂肪、蛋白质代谢过程的酶类,还通过介导基因转录和翻译过程,影响能量代谢,表明该酶系在维持能量稳态过程中起重要作用。高原地区影响人们健康和劳动效率的最主要因素是缺氧。缺氧引起线粒体的氧化磷酸化功能障碍,造成能量产生减少。维持能量平衡现已成为减轻缺氧损伤的关键问题。我们推测AMPK可能是缺氧能量稳态调节的一个重要因素。脑组织代谢率高,对氧和能量的需求量大但储备低,这些特点决定了脑对缺氧和能量不足最敏感易受到损伤。因此,研究AMPK在脑内的生物学效应和调节机制,将为寻求高原低氧环境下的促习服措施提供理论和实验依据。AMPK可能成为一个极具潜力的新型抗缺氧损伤的靶点。蛋白质是生命活动的执行者,生命活动内在本质的生物化学和/或催化活性在很大程度上受到蛋白质相互作用的调节。因此,探究具有相互作用关系的蛋白对将有助于功能提示。为此,我们有必要寻找与AMPK相互作用的蛋白质以促进其功能的阐明。AMPK是一个由α、β、γ亚基形成的异源三聚体,α为催化亚基,β和γ为调节亚基。三种亚基存在不同的亚型,如α1和α2,β1和β2,γ1、γ2和γ3。α催化亚基作为AMPK的特征性结构,与该结构域相互作用的蛋白质在一定程度上代表了特异地与AMPK相互作用的分子。本研究选择在脑神经元中含量较高的α2亚基作为诱饵,利用大肠杆菌双杂交系统筛选胎脑cDNA文库寻找与其相互作用的蛋白,为进一步了解AMPK在脑内能量稳态调节中的作用奠定基础,同时也为今后阐明AMPK在脑内缺氧习服适应中的作用机制提供新的思路。 本研究进行了以下工作: 1.AMPKα2亚基编码区片段的克隆及大肠杆菌双杂交诱饵质粒的构建与鉴定采用PCR法扩增AMPKα2亚基的编码区序列,将其构建到带有λcI基因的克隆载体pBT上,与λcI基因形成融合基因,获得pBT-AMPKα2重组质粒,并保持目的基因的阅读框与λcI基因的阅读框一致。DNA测序结果表明,重组质粒中AMPKα2编码区的碱基序列和阅读框均正确,pBT-AMPKα2重组质粒(即诱饵质粒)构建成功。 2.诱饵质粒的表达及自激活作用检测 (1)将诱饵质粒pBT-AMPKα2转化入大肠杆菌XL1-Blue MR感受态细胞,在37℃培养条件下IPTG诱导重组融合蛋白的表达。提取大肠杆菌的全细胞裂解产物以及裂解上清和沉淀,SDS-PAGE检测蛋白表达,未见AMPKα2-λcI融合蛋白的表达。用Western blotting免疫印迹予以进一步鉴定,结果显示有AMPKα2-λcI融合蛋白的表达,且存在可溶性蛋白和不溶性包涵体两种形式,其中可溶性形式存在的AMPKα2-λcI融合蛋白易发生分解,产生AMPKα2和λcI蛋白;不溶性包涵体形式存在的AMPKα2-λcI融合蛋白不发生分解,稳定存在。 (2)重组质粒pBT-AMPKα2和空质粒pTRG共转化大肠杆菌XL1-Blue MR报告菌株,在no 3-AT非选择性培养基平板及3-AT选择性培养基平板上培养,观察菌落生长情况,并与阴性对照(即pBT空质粒和pTRG-Gal11p共转化大肠杆菌XL1-Blue MR报告菌株)比较。结果显示,阴性对照组中的转化子在no 3-AT平板上生长良好,而在3-AT平板上无菌落生长,表明3-AT培养板的质量可靠;重组质粒pBT-AMPKα2和空质粒pTRG共转化结果显示,转化子在no 3-AT平板上生长良好,而在3-AT平板上不生长,表明重组质粒pBT-AMPKα2并无自主活化作用,可用于下一步的双杂交筛选实验。 3.cDNA文库的扩增及AMPKα2亚基相互作用蛋白的筛选和初步鉴定 (1)按文库操作说明对cDNA文库进行扩增,收获的扩增文库经梯度稀释后涂板,随机挑取10个菌落,抽提质粒后进行序列测定,结果显示10个菌落测序的碱基序列均不相同,说明扩增文库未发生偏移,文库多样性仍保持。 (2)用CaCl_2法小量共转化50ng pBT-AMPKα2重组质粒和50ng pTRG文库质粒入100μl XL1-Blue MR大肠杆菌细胞,即先导文库共转化。根据先导文库共转化的结果估算筛选一定数量的文库克隆所需的大规模共转化反应的数量。然后用CaCl_2法大量共转化200ng pBT-AMPKα2重组质粒和200ng pTRG文库质粒入500μl大肠杆菌XL1-Blue MR细胞。通过在3-AT选择性筛选培养基上培养,以及假定相互作用子的富集,结果获得592个能够表达HIS3报告基因的初筛克隆。 (3)将筛选得到的初筛克隆全部补缀于含有3-AT和链霉素(Strep)的选择性筛选培养基上进行第二次筛选,结果发现有20个克隆不能生长而被去除,其余克隆生长良好。这是利用HIS3和aadA报告基因的表达排除假阳性克隆。 (4)从第二次筛选得到的克隆中挑取最早长出的20个克隆进行质粒抽提,转化大肠杆菌XL1-Blue MRF’Kan感受态细胞,转化产物铺于含有四环素(Ter)的LB琼脂平板(LB-Ter),并通过LB-Ter琼脂平板和含有氯霉素(Cam)的LB琼脂平板(LB-Cam)进行纯化,对20个克隆进行鉴定。结果显示,有1个克隆是假阳性克隆,剩余19个是阳性侯选克隆。 (5)将阳性侯选克隆回复至大肠杆菌XL1-Blue MR报告菌株中进行验证。19个阳性侯选克隆对应的pTRG靶质粒分别与pBT-AMPKα2诱饵质粒以及pBT空质粒共转化大肠杆菌XL1-Blue MR报告菌株,在3-AT选择性筛选培养基上培养,结果显示有9个阳性侯选克隆具有与诱饵蛋白AMPKα2特异性结合的特性,为真阳性克隆。 (6)抽提阳性克隆质粒,进行测序,并将结果与GenBank数据库进行同源性比较分析,结果获得7种AMPKα2的结合蛋白。它们分别是:磷酸果糖激酶、聚合泛素、细胞色素C氧化酶亚基I(COX I)、热休克蛋白8(HSP8)、人类白细胞抗原B关联性转录物3(BAT3)异构体1、蛋白酪氨酸磷酸酶受体型D(Ptprd)、岛-脑蛋白1(IB1),涉及糖酵解、蛋白质降解、线粒体电子传递链以及凋亡调控等多条途径,直接或间接参与能量调节。


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