收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

奥沙利铂联合CD-Endostatin融合基因对直肠癌杀伤作用的研究

陈纲  
【摘要】: 直肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一,近年来发病率呈显著上升趋势。目前传统的治疗手段如放疗、化疗、手术等未能明显提高直肠癌患者的5年生存率。因为化疗、放疗等在治疗肿瘤的同时对正常组织亦存在损伤,使用剂量受到限制。且部分肿瘤出现对化疗及放疗的耐受也影响了其疗效。随着对结直肠癌基因研究的深入,直肠癌的各种基因治疗正逐渐受到重视。目前最有临床应用前景的基因治疗方法包括自杀基因治疗及抗血管生成基因治疗等。 抗血管生成基因治疗是指应用基因表达与调控等手段抑制实体瘤的血管生长,切断肿瘤的营养供给,对肿瘤采取饥饿疗法,从而达到治疗肿瘤的目的。在这方面的研究中,Endostatin(内皮抑素)是最新发现的强有力的新生血管内皮细胞生成的抑制剂,能够抑制体内多种实体瘤的生长,已显示出广阔的临床应用前景。 自杀基因系统以其多方面的优越性在肿瘤基因治疗中倍受关注,它通过直接杀伤作用及“旁观者效应”发挥抗肿瘤效应。大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase,CD)基因是继单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV2TK)后又一重要的自杀基因,与HSV2TK相比,CD基因具有更强的"“旁观者效应”及存在远距离“旁观者效应”的特点,CD自杀基因治疗(亦称分子化疗)肿瘤具有广泛的应用前景,在美国被称为最有前途的基因治疗方案。 利用基因工程技术,将抗血管生成基因治疗的Endostatin基因、CD自杀基因融合,协同作用于直肠癌。鉴于脂质体转染基因具有安全性,不产生排异反应,可反复转染等优点,但不足是转染效率不如病毒载体高。如果将脂质体转染基因治疗和第三代铂类化疗药物奥沙利铂结合起来,既可以利用奥沙利铂存在的对脂质体促进转染作用,克服脂质体转染效率低下的不足,使基因治疗与化疗有机的结合起来,无疑为恶性肿瘤的治疗又增加了新的手段和方法。 目的明确奥沙利铂促进脂质体对直肠癌细胞的转染效率,探讨奥沙利铂联合CD-Endostatin对直肠癌细胞的协同杀伤作用。将奥沙利铂联合脂质体转染CD-Endostatin基因对HR-8348直肠癌荷瘤鼠治疗,观察其疗效,从而为临床治疗直肠癌提供理论依据。 方法一、构建含融合基因pcDNA-CD-sED质粒。二、脂质体法,体外转染含有CD基因、CD-Endostatin基因的质粒于直肠癌细胞株HR-8348,用G418(400ug/L)继续培养筛选转染阳性细胞,同时用未转染的HR-8348细胞做对照。观察对照细胞大部分死亡时,更换G418(200ug/L)维持筛选。15天后观察抗性克隆形成。获得稳定表达的克隆细胞,传染至HR-8348细胞后的阳性克隆子分别命名HR-8348CD(转染pcDNA-CD质粒), HR-8348ECD(转染pcDNA-CD-sED质粒),挑出阳性克隆,扩增培养。含绿色荧光蛋白(GFP)基因质粒转染HR-8348细胞,用奥沙利铂促转染,用GFP基因表达绿色荧光蛋白观察脂质体转染效率及奥沙利铂的促转染作用。三、Western印迹检测pcDNA-CD-sED转染不同时间后细胞裂解液中Endostatin蛋白表达。用MTT法测定转染CD-Endostatin基因阳性克隆子表达Endostatin蛋白的上清液对人脐静脉内皮细胞的抑制作用。四、MTT检测奥沙利铂联合CD-Endostatin基因对HR-8348细胞杀伤作用。五、荷瘤裸鼠的制备及分组:将HR-8348细胞0.2ml(0.5×107细胞/ml)接种于4-5周BALB/C-nu/nu裸鼠右侧后肢外侧皮下,待瘤体长至长径达0.5cm后,用随机数字法将裸鼠分为4组:(1)奥沙利铂联合CD-Endostatin基因组:通过尾静脉注入低剂量的奥沙利铂2.5mg·kg-1,应用1ml注射器对每个肿瘤于奥沙利铂作用后第0、4、8、12天多点注射(至少4个点)200ul Lipofectin- pcDNA-CD-sED复合体;第3天开始腹腔注射5-FC 500mg/kg/day,连续12天。(2)奥沙利铂联合CD基因组10只:通过尾静脉注入低剂量的奥沙利铂2.5mg·kg-1,应用1ml注射器对每个肿瘤于第0、4、8、12天多点注射200ul Lipofectin-pcDNA-CD复合体;第3天开始腹腔注射5-FC 500mg/kg/day,连续12天。(3)奥沙利铂组10只:通过尾静脉注入低剂量的奥沙利铂2.5mg·kg-1,只注射生理盐水,200ul生理盐水于第0、4、8、12天行瘤体内多点注射。(4)空白对照组:只注射生理盐水,200ul生理盐水于第0、4、8、12天行瘤体内多点注射。于治疗后28天拉颈法处死各组裸鼠。绘制荷瘤裸鼠的肿瘤生长曲线,计算瘤体积抑制率及瘤重抑制率。免疫组化染色观察肿瘤内部的新生血管密度。六、统计学处理:均数应用x±s表示,应用SPSS10.0统计软件行χ2检验和方差分析,以P0.05为统计学显著差异。 结果一、倒置荧光显微镜观察GFP蛋白显示:经奥沙利铂作用后,脂质体转染细胞的转染效率明显增强(可提高18倍左右),可利用奥沙利铂促进脂质体转染基因治疗。二、Western印迹检测pcDNACD-sED转染不同时间后细胞裂解液中人Endostatin蛋白显示:感染细胞24h后表达人Endostatin蛋白,在120h达到高峰,并持续到180h,说明Endostatin基因在HR-8348细胞获得高效及长时间的表达。CD-Endostatin基因阳性克隆子表达Endostatin蛋白的上清液对人脐静脉内皮细胞的有明显的抑制作用。三、体外试验结果显示:联合CD基因及5-FC系统能够明显增强对HR-8348细胞的杀伤效率,用IC50浓度的奥沙利铂作用,转染CD基因的HR-8348细胞实验组细胞抑制率均值为86.2%,转染CD-Endostatin基因组与单纯转染CD基因无明显差异;未转染CD基因的HR-8348细胞对照组细胞抑制率均值为48.1%,其差异有显著性意义(p0.05)。四、荷瘤小鼠肿瘤抑制率结果显示:奥沙利铂联合CD-Endostatin基因组,奥沙利铂联合CD基因组,奥沙利铂组肿瘤生长抑制率分别为79.69%、51.67%、37.67%,奥沙利铂联合CD-Endostatin基因组较奥沙利铂治疗组、奥沙利铂联合CD基因组差异有显著性(P0.01)。五、癌组织病理学检查结果:奥沙利铂联合CD-Endostatin基因组的肿瘤细胞数目较其它三组明显减少,肿瘤细胞呈退行性病变,核分裂相明显减少,不见瘤巨细胞,而肿瘤细胞被大量的脂肪细胞所代替。同时,奥沙利铂联合CD-Endostatin基因组可明显减少肿瘤内部的新生血管密度,其他治疗组较对照组减少肿瘤内部的新生血管密度不明显。 结论1、化疗药物奥沙利铂具有提高脂质体对直肠癌细胞HR-8348转染效率的作用,应用奥沙利铂后的转染效率能接近病毒载体转染水平。2、Endostatin在体外试验中能抑制内皮细胞增生,小鼠荷瘤试验证明了Endostatin通过抑制内皮细胞增生来控制肿瘤新生血管的形成,从而达到阻止直肠癌生长及转移。3、CD-Endostatin联合基因治疗,从肿瘤治疗的两个重要方向即肿瘤细胞内靶向化疗与抑制肿瘤新生血管形成,协同发挥CD基因、Endostatin基因对直肠癌的杀伤作用。4、利用脂质体反复转染CD-Endostatin基因联合奥沙利铂治疗HR-8348荷瘤鼠,肿瘤体积抑制率为81.5%,瘤重抑制率分别为79.69%,治疗效果显著,且无明显的毒副作用。5、本实验将融合基因治疗、化疗有机的结合起来,可产生协同作用,对直肠癌治疗疗效显著,这将为治疗恶性肿瘤提供了一个很好的思路,同时也为临床治疗癌症可能提供了理论以及实践的依据。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 施平,张中华;奥沙利铂为主的化疗方案治疗晚期大肠癌28例[J];医学临床研究;2004年07期
2 张怡梅;朱严冰;倪海英;孟冀昌;苏同义;;奥沙利铂联合亚叶酸钙和5-氟尿嘧啶治疗晚期大肠癌34例[J];华北国防医药;2006年01期
3 吉林;曾令源;陈念永;郞锦义;;奥沙利铂为主的联合化疗结合同期放射治疗晚期直肠癌[J];中国癌症杂志;2002年05期
4 翁洁,管丽莉,刘颂莲;奥沙利铂辅助治疗大肠癌疗效观察[J];医学临床研究;2005年04期
5 殷咏梅,束永前,黄普文,卢凯华,仇金荣;奥沙利铂联合氟尿嘧啶、亚叶酸钙治疗结直肠癌肝转移的疗效观察[J];南京医科大学学报(自然科学版);2003年03期
6 陆宁;内皮抑素与恶性肿瘤治疗[J];天津医药;2001年11期
7 王朱逸,王瑶;内皮抑素抗肿瘤作用研究进展[J];同济大学学报(医学版);2003年03期
8 王晓燕,孙汶生,马春红,袁中芳,赵东,国纪林;重组内皮抑素对碱烧伤诱导角膜新生血管的抑制作用[J];山东大学学报(医学版);2004年04期
9 吴扬,杨莉,赵霞,宿静梅,胡兵,刘继彦,牛挺,罗彦,李秋,魏于全;重组人内皮抑素腺病毒抗肿瘤实验研究[J];中华医学遗传学杂志;2004年06期
10 冯玉梅,冯怡,马清钧;内皮抑素在新生血管形成相关疾病中的作用机制研究进展[J];生物技术通讯;2005年03期
11 季现秀;范理宏;;内皮抑素的生物活性及作用机制的研究进展[J];临床肺科杂志;2010年01期
12 吴晓!100083,郑杰!100083,朱建健!100083,付坚!100083,马春树!100083,由江峰!100083,崔湘琳!100083,王洁良!100083,方伟岗!100083,周爱儒!100083,汤健!100083,吴秉铨!100083;反义VEGF基因及内皮抑素基因转染对人巨细胞肺癌生物学行为的影响[J];中国肺癌杂志;2001年02期
13 欣坚;内皮抑素的研究进展[J];中国肿瘤生物治疗杂志;2003年01期
14 马凌云,李强,刘忠令;内皮抑素与肿瘤研究新进展[J];国外医学.呼吸系统分册;2004年S1期
15 吕惠兰,宫良平,邵震宇,殷进军,王涛,史斌;低剂量奥沙利铂并氟脲嘧啶对晚期复发直肠癌放疗增敏作用的临床观察[J];中国现代普通外科进展;2005年03期
16 陈纲;李世拥;;内皮抑素基因治疗在结直肠癌中的应用[J];腹部外科;2009年03期
17 张贺诚;陈正光;;内皮抑素及内皮抑素基因抗肿瘤的分子影像学研究进展[J];放射学实践;2009年12期
18 屈延,章翔,吴景文,柴玉波,吴元明,高大宽;小鼠内皮抑素基因的克隆及序列测定[J];第四军医大学学报;2000年10期
19 骆成玉,曾胜,赵丹宁,刘元林,李世拥,杨晓明,梁龙,祝学光;肌肉注射内皮抑素基因抑制人大肠癌生长的研究[J];中华实验外科杂志;2001年05期
20 张国锋,王元和,张明敖,王强,罗芸葆,韩策然,陆友国,饶应阳;内皮抑素对胃癌抑制作用的实验研究[J];中华外科杂志;2002年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 王方彤;钟宁;庄镇华;;奥沙利铂的体内抗肿瘤药效学研究[A];中国药理学会第九届制药工业药理学术会议论文摘要汇编[C];2000年
2 郑小华;夏雅芬;;预防奥沙利铂神经毒性反应的护理体会[A];全国内科护理学术交流暨专题讲座会议论文汇编[C];2003年
3 王新颖;王继德;姜泊;;MAPK信号通路在奥沙利铂诱导PUMA表达致肠癌细胞凋亡过程中的作用[A];中华医学会第七次全国消化病学术会议论文汇编(下册)[C];2007年
4 来娟;;奥沙利铂联合氟尿嘧啶化疗治疗结肠癌术后病人的护理[A];全国肿瘤护理学术交流暨专题讲座会议论文汇编[C];2005年
5 吕万丽;胡君娥;张艳;王卫锋;;奥沙利铂所致不良反应的护理[A];全国肿瘤护理学术交流暨专题讲座会议论文汇编[C];2006年
6 张玉红;;奥沙利铂联合氟尿嘧啶治疗肠道肿瘤毒副反应的观察及护理[A];中华护理学会全国肿瘤护理学术交流暨专题讲座会议论文汇编[C];2009年
7 潘秋香;;奥沙利铂联合5-氟尿嘧啶及亚叶酸钙化疗引起腹泻的个案护理[A];中华护理学会2009全国护理管理学术交流暨专题讲座会议;中华护理学会2009全国护理新理论、新方法、新技术研讨会论文汇编[C];2009年
8 潘秋香;;奥沙利铂联合5-氟尿嘧啶及亚叶酸钙化疗引起腹泻的个案护理[A];中华护理学会全国肿瘤护理学术交流暨专题讲座会议论文汇编[C];2010年
9 蔡钢;陈佳艺;朱骥;俞晓立;章真;郭小毛;胡超苏;;5-Fu/奥沙利铂/西乐葆联合放疗治疗不可切除直肠癌Ⅱ期研究初步分析[A];2007第六届全国放射肿瘤学学术年会论文集[C];2007年
10 丁小南;袁建华;俞文强;胡庭扬;陈方宏;周俊;罗祖炎;刘斯建;;奥沙利铂方案介入治疗肝癌的研究[A];2005年浙江省放射学学术年会论文汇编[C];2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 陈纲;奥沙利铂联合CD-Endostatin融合基因对直肠癌杀伤作用的研究[D];第三军医大学;2007年
2 李攀;超声破坏微泡介导内皮抑素基因治疗肝癌及其机制研究[D];重庆医科大学;2012年
3 刘波;经肛门内镜显微手术治疗直肠肿瘤的临床评价及可行性分析[D];山东大学;2012年
4 庄宝雄;奥沙利铂脂质体的生物学研究[D];中南大学;2011年
5 张新科;穿膜肽Tat PTD介导的内皮抑素穿透眼球屏障及对眼部血管增生抑制作用的研究[D];山东大学;2012年
6 郭立达;姜黄素联合奥沙利铂抗结肠癌作用及其相关机制研究[D];河北师范大学;2012年
7 陈卫昌;内皮抑素治疗结肠癌的实验研究[D];苏州大学;2002年
8 杨闯;抗VEGFR2-奥沙利铂免疫脂质体对结直肠癌靶向治疗的研究[D];重庆医科大学;2011年
9 李井泉;PLGA-奥沙利铂缓释微球间质化疗应用于结直肠癌治疗的实验研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2009年
10 刘晓强;内皮抑素重组腺病毒载体的构建及其对膀胱癌生长抑制作用的研究[D];天津医科大学;2003年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 郎哲;尼美舒利联合奥沙利铂对人肺癌裸鼠移植瘤的治疗作用及其作用机制的研究[D];河北医科大学;2010年
2 俞芳;和厚朴酚联合低剂量奥沙利铂诱导肺腺癌A549细胞凋亡的实验研究[D];浙江大学;2010年
3 张帆;奥沙利铂联合榄香烯对人肺癌细胞生长抑制和凋亡的体外研究[D];中国医科大学;2010年
4 梁滨;Herceptin联合奥沙利铂对胃癌细胞侵袭转移的研究[D];山西医科大学;2011年
5 郑炜望;消癌平注射液及其与奥沙利铂和恩度联合对STAT3信号通路及相关蛋白影响的实验研究[D];南京中医药大学;2010年
6 宋姗爱;XPG基因多态性与奥沙利铂对晚期胃癌疗效的相关性[D];青岛大学;2010年
7 马继恒;消癌平注射液及其与奥沙利铂和恩度联合抗肝癌血管生成的实验研究[D];南京中医药大学;2010年
8 姜健;XRCC1G399A单核苷酸多态性与晚期胃癌患者对奥沙利铂化疗敏感性的关系[D];青岛大学;2010年
9 田殿锋;Herceptin联合奥沙利铂对胃癌细胞体外作用的研究[D];山西医科大学;2011年
10 郭超;组织因子对奥沙利铂抑制人胃癌细胞侵袭及诱导人胃癌细胞凋亡的影响[D];兰州大学;2010年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 衣晓峰 通讯员 张长鑫;“石女”摆脱直肠肿瘤[N];健康报;2011年
2 张骁;奥沙利铂的不良反应[N];中国医药报;2004年
3 黄灿 编译;奥沙利铂有望取代顺铂[N];医药经济报;2011年
4 衣晓峰 张长鑫;直肠肿瘤手术可采用“外横内纵”入路新术式[N];中国医药报;2010年
5 刘扬;奥沙利铂进入抗肿瘤一线阵地[N];中国医药报;2005年
6 凌栋;针对Ⅱ、Ⅲ期结肠癌的辅助治疗——添加奥沙利铂对年轻患者有益[N];中国医药报;2011年
7 阿华;考虑使用奥沙利铂+伊立替康[N];医药经济报;2004年
8 闵建颖;上海瑞金医院微创术根治直肠肿瘤[N];家庭医生报;2004年
9 王立峰;奥沙利铂:领跑铂类药物市场[N];中国医药报;2003年
10 本报特约撰稿人 蔡德山;抗肿瘤药全球市场异曲同工[N];医药经济报;2006年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978