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动脉粥样硬化的免疫炎症机制及三七皂苷的调控作用

樊继山  
【摘要】: 背景与目的:大量的临床和流行病学调查发现慢性炎症患者和自身免疫性疾病患者AS发病率明显升高,提示免疫炎症与动脉粥样硬化存在密切关系。由于以往的研究所用的模型均缺乏免疫炎症反应直接诱发AS这种特异性,不能很好的说明免疫炎症反应和AS之间的确切关系。那么究竟免疫炎症是引起AS的病因还是AS的伴发现象?这是目前亟待解决的关键问题。鉴于啮齿类动物AS病变更类似人类,因而制备一种方便可靠的啮齿类动物免疫炎症性AS模型,对于研究相关机制来说是必要的。细胞因子是免疫炎症反应的代表性产物和刺激物,明确众多细胞因子在AS中的变化规律有助于进一步探寻免疫炎症机制的作用规律及其意义。抗体芯片技术为此提供了可靠的技术手段。核转录因子NF-κB、AP-1是调节炎症介质和细胞因子生成的上游共享分子,JNK和p38是与炎症反应密切相关的信号转导分子,因此,明确AS病变中免疫炎症相关因子的动态变化及信号分子NF-κB、AP-1、JNK和p38的变化对于揭示AS病变的免疫炎症机制具有重要意义。三七皂苷具有抗AS的作用,对多种急慢性炎症有显著疗效并具有免疫调节作用,有理由推测三七防治AS的机制与其调节免疫炎症效应有关。因此,通过采集AS病灶部位及泡沫细胞中多种化学信号分子的动态变化数据,不但有助于揭示细胞信号转导的某些规律,更重要的是为探索中药三七防治AS的免疫炎症调节机制提供极有价值的线索。 方法: 1、无菌条件下腹腔注射酵母多糖(Zym)-液体石蜡混悬液20mg/kg体重,间隔5天给药一次,观察Zym在大鼠体内致炎效果。采用免疫和炎症刺激的方法(Zym叠加卵蛋白)在高脂喂养的基础上诱导大鼠AS的形成,探讨免疫炎症与AS之间的关系,同时以求获得免疫炎症因素诱导的大鼠AS模型。 2、在我室既往基因芯片检测的基础上,采用细胞因子抗体芯片并行检测免疫炎症刺激因素下3、6、10周时形成的AS中炎性相关因子的动态变化及三七皂苷的影响,以期探索炎症相关因子在AS形成过程中的作用规律及其意义,为寻找防治AS的分子靶点提供实验资料和线索。 3、采用免疫组化方法,检测免疫炎症性AS病变局部3、6、10周时NFkB/P65、c-Jun/AP-1的动态变化;oxLDL、oxLDL+Zym、oxLDL+Zym +PNS50μg、oxLDL+Zym +PNS100μg分别作用于小鼠腹腔巨噬细胞,诱导泡沫细胞形成,利用western blot技术检测JNK和p38磷酸化水平。 结果: 1、间隔5日一次腹腔注射酵母多糖-液体石蜡混悬液20mg/kg,给药两次后,白细胞计数显示24小时即明显升高达高峰,48小时-120小时保持高水平与给药前比较有显著差异,144小时后即二次给药后6天时降至正常水平,动物无一死亡。表明此方法可以引发大鼠体内可控制的炎症反应。在高脂饮食的基础上,应用Zym叠加OVA刺激大鼠10周,模型组大鼠血清总胆固醇及循环免疫复合物均明显高于高脂对照组,电镜观察显示10周末模型组主动脉壁可见血源性泡沫细胞形成。 2、抗体芯片显示, 3周时模型组动脉壁中IL-1α、MCP-1、TNF-α三种致炎因子处于明显升高状态;PNS可以明显抑制IL-1a、MCP-1的水平,但对TNF-α作用不明显。6周时有更多的趋化因子表达增加如CINC-2、CNTF、FKN、LIX,此时IL-6开始升高,PNS对它们的抑制作用明显。10周时,除了一些趋化因子和炎症免疫因子的增加外,还检测到GM-CSF、IFN-γ、Leptin的明显升高,它们在促进泡沫细胞形成中具有显著作用,可能是在此前持续的免疫炎症反应的基础上最终导致泡沫细胞形成的关键因素,这与此时电镜切片可以观察到泡沫细胞相一致。PNS同样能够降低三者的水平。在大鼠动脉壁泡沫细胞形成的整个过程中,4种细胞因子处于持续升高趋势,包括CINC-2、CNTF、LIX、VEGF;6种呈现逐渐升高趋势,包括CINC-3、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、Leptin、β-NGF; 5种因子包括Fractalkine、IL-6、IL-1α、IL-10、TNF-α处于波动状态;MCP-1在3周时明显升高,其它时相点变化幅度不大,MIP-3a、TIMP-1、IL-4在整个病变过程中变化幅度始终较平稳。IL-4、IL-10目前被认为在AS中是抗炎抗动脉硬化的因子,我们发现除IL-10在6周时有所升高外均处于降低或变化平稳的状态。 3、在AS模型大鼠主动脉壁中,NF-κB/P65主要表达于内皮细胞和内膜下间隙的炎症细胞,外膜层亦有少量表达,胞核可见明显的阳性表达颗粒。表明这些阳性细胞中NF-κB均处于活化状态。模型组3周时NF-κB即有明显升高,并随着病程的进展呈进行性增高趋势,而在高脂对照组并未呈现出模型组中NF-κB表达的进行性升高趋势。c-Jun/AP-1的表达阳性细胞位于动脉壁全层,包括内皮细胞、内膜下层炎性细胞、平滑肌细胞等;并且3周时c-Jun/AP-1的表达即呈现明显升高,此后6、10周时处于持续升高状态。三七皂苷对二者的高表达均有明显的抑制作用。酵母多醣在体外可以明显促进巨噬细胞源性泡沫细胞的形成,泡沫细胞内脂质沉积量也明显升高并且PNS对其有明显的抑制作用,ox-LDL组少量表达p-p38、p-JNK。oxLDL+Zym组中p-p38、p-JNK的表达明显高于ox-LDL对照组。oxLDL+Zym +PNS50μg组、oxLDL+Zym +PNS100μg组中p-p38、p-JNK的表达量明显减少。在检测JNK磷酸化的结果中发现,仅检测出54KD的JNK2,却没有发现46KD的JNK1。PNS能有效的抑制Zmy对ox-LDL刺激引起的巨噬细胞源性泡沫细胞中p38、JNK的磷酸化的增强作用,并呈剂量依赖性。 结论: 1、我们应用Zym诱发无菌性炎症叠加OVA接种刺激机体免疫反应诱导大鼠动脉壁泡沫细胞形成,成功建立了一种啮齿类(大鼠)免疫炎症性AS模型,这同时也证明,除高血脂之外免疫炎症反应也是导致AS的重要原因。 2、抗体芯片检测AS病变局部细胞因子的动态变化显示,炎症免疫因素诱发AS形成的不同阶段,由不同的炎症免疫因子起到主导作用,导致了抗炎和致炎因子的失衡,这可能就是单纯控制血脂水平的情况下心血管疾病的发病率仍在持续上升以及自身免疫性疾病和慢性炎症性疾病患者动脉粥样硬化发病率大幅升高等临床现象的原因。 3、在免疫炎症性AS病变中,NF-κB/p65处于进行性升高的趋势,c-Jun/AP-1在病变的起始阶段即明显升高,并持续处于高水平。二者的高表达是免疫炎症状态下细胞因子紊乱的机制之一,干预这两个上游共享分子可以调控紊乱的细胞因子表达。4、p38、JNK的异常激活涉及了oxLDL叠加Zym诱导泡沫细胞形成的过程,其中JNK2是泡沫细胞形成中JNK活化的主要亚型。表明在免疫炎症性AS过程中,活化的JNK和p38可以通过增强多种转录因子包括AP-1和NF-κB的转录活性而调节细胞因子和炎性介质的表达。 5、在免疫炎症性AS中,由于细胞因子之间的网络作用,如果只单独干预某一个因子不能产生很好的治疗效果。三七皂苷能够在AS早期阶段调控整体细胞因子的水平,这可能是其抗AS疗效显著的重要原因。三七皂苷对NF-κB、AP-1、p38、JNK异常激活的抑制作用可能是其调控细胞因子和炎性介质的表达,有效防治AS的分子机制之一。


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