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新生儿黄疸的预测、干预治疗措施研究

陈霞  
【摘要】: 目的 严重高胆红素血症可以导致胆红素脑损伤甚至核黄疸。为了减少严重高胆红素血症及胆红素脑损伤甚至核黄疸的发生,本课题从临床、实验方面进行了研究,分为三个阶段进行。①寻找一种简单易行的临床指标,预测新生儿高胆红素血症的发生。故通过测定早产儿及足月儿脐血甲胎蛋白值,探讨脐血甲胎蛋白水平与新生儿黄疸发生是否存在相关性。同时需要了解生后血清甲胎蛋白与胆红素水平的相关性。②UGT1A1的活性与血清胆红素水平密切相关,因此研究大鼠肝脏发育不成熟期其葡萄糖醛酸转移酶1A1活性的发育规律,为如何预防及基因治疗新生儿高胆红素血症提供实验依据。⑨基因治疗新生儿高胆红素血症能较长时间维持低血清胆红素水平,因此是非常有前景的治疗方案。首先获得表达尿苷二磷酸葡萄糖醛酸酶(UGT1A1)基因;构建UGT1A1重组腺相关病毒载体,为应用UGT1A1重组腺相关病毒载体纠正UGT1A1基因缺陷所致UGT1A1减少或缺失而发生的高胆红素血症做前期准备。 方法 1、检测早产儿及足月儿脐血AFP和血清胆红素。 (1)取38例早产儿(其中胎龄在32周~33周8例,34周~35周13例,36周~<37周的17例)脐血标本各2ml测定AFP值,所有早产儿在生后3天(57±10h)测定血清总胆红素水平。 (2)取120例足月儿脐血测定AFP值,并测定生后3天的总胆红素值,再随机抽取其中发生高胆红素血症的患儿25例为实验组,以未发生高胆红素血症的新生儿30例作为对照组测定生后1月内血清AFP值。 绘制散点图,求直线回归方程。 2、用Matern方法放射测定不同孕龄(孕17天~19天各5只)及出生后不同日龄(生后1~5天各10只,生后2周的5只)大鼠的肝脏葡萄糖醛酸转移酶1A1活性,并制作放射自显影图。 3、设计、合成引物,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从HepG2细胞总RNA中扩增UGT1A1基因,构建UGT1A1基因克隆载体,阳性重组子筛选和测序。UGT1A1最终连接于pAAV-MCS,双酶切、PCR鉴定阳性重组质粒。pAAV-UGT1A1、pAAV-RC、pHelper同时转移入HEK293T细胞,光镜下观察转染后细胞的形态变化,荧光显微镜下记数发绿色荧光的细胞,间接了解转染的效率,并测定重组腺相关病毒的滴度。 结果 1、早产儿组脐血AFP值与生后3天的总胆红素值呈线性相关。足月儿组脐血AFP值与生后3天的总胆红素值呈线性相关。生后1月内血清AFP值实验组与对照组存在显著性差异(P<0.01)。 2、大鼠肝脏在孕17天~19天UGTlAI活性较低,而且增长幅度小,孕19天UGT1A1活性占成熟鼠活性的6.7%。生后1~2天时增长幅度很大,生后5天基本达成熟鼠水平,占成熟鼠活性的88.1%。将孕17天、孕19天、生后1天、成熟鼠这4组UGT1A1活性进行统计学检验,差异具有统计学意义。从放射自显影图可以更加明确此规律。 3、成功扩增了人类UGT1A1基因,筛选出UGT1A1基因阳性克隆载体。UGT1A1连接于pAAV-MCS,构建表达UGT1A1基因重组腺相关病毒载体,并成功表达于HEK293T细胞。转染了UGT1A1基因重组腺相关病毒载体的细胞光镜下出现皱缩、脱落,荧光显微镜下可见多个细胞显示很强的绿色荧光,提示转染效率较高,可达70%以上。经计算病毒滴度为10~(5.6)PFU/ml。 结论 1、新生儿甲胎蛋白值可作为肝脏发育成熟度的标志,为临床预测高胆红素血症发生提供了另一指标。脐血甲胎蛋白值的范围对预测胆红素水平也有关。此项测定可以对严重的高胆红素血症进行预测,以便及早进行干预治疗,该项检测容易在临床中推广使用。 2、不成熟大鼠肝脏葡萄糖醛酸转移酶1A1活性很低,生后活性迅速增加达到成熟水平。研究结果提供了围产期和成熟期UGT1A1活性的实验依据。可以选择有效的时间段,对因肝脏葡萄糖醛酸转移酶1A1活性不足导致的新生儿高胆红素血症进行基因治疗。 3、本实验成功构建了人类UGT1A1重组腺相关病毒载体,为因UGT1A1活性不足导致的高胆红素血症的基因治疗奠定基础。


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