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2’,5,6’,7-四羟基二氢黄酮醇的定向分离及其拮抗细菌脓毒症的生物学活性评价

伏建峰  
【摘要】: 脓毒症是感染因素介导的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS),是烧伤、创伤和感染性疾病患者的常见并发症。流行病学资料显示,每年全球有超过1800万的脓毒症病例,且患者数目每年以1.0%速度递增。重症脓毒症和脓毒性休克是重症监护病房(intensive care units, ICU)病人死亡的首要因素,死亡率高达50%-60%。 内毒素(endotoxin/Lipopolysaccharide, LPS)是G-菌外膜的主要成分,是介导细菌脓毒症的重要病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)。LPS进入机体内后,首先与内毒素结合蛋白(lipopolysaccharide-binding protein,LBP)结合,在LBP的作用下,LPS与单核/巨噬细胞膜上的受体CD14结合形成LPS-CD14复合物,复合物中的LPS与跨膜受体TLR4(Toll like receptor 4,TLR4)结合,将信号转入胞内,导致靶细胞的活化,释放TNF-α、IL-6等炎症介质,介导脓毒症的发生。尽管对脓毒症的病理生理机制及其防治策略的研究较为深入,但至今仍无特殊有效的药物供临床治疗。 中草药在脓毒症中的应用具有悠久的历史,已证实多种中草药具有较好的拮抗内毒素作用,但由于中药成分复杂,加之缺乏有效的分离检测手段,限制了中草药在脓毒症防治中的应用与发展。在前期的研究中,我们将LPS的活性中心Lipid A包被于生物传感器上,建立了以Lipid A为靶点的筛选拮抗LPS药物的实验平台。基于此技术平台,本研究采用大孔吸附树脂、超滤膜分离和高效液相色谱(high performance liquid chromatogram, HPLC)技术,对中药水提液进行多级分离纯化,以期从天然药物中获取具有拮抗LPS活性的单体化合物,为脓毒症防治药物的研发提供新的思路和方法。 方法 1.应用以Lipid A为靶点的生物传感器技术平台,检测60种中药水煎液与Lipid A的结合活性;对明确具有与Lipid A结合活性的中药,采用大孔吸附树脂分离技术、超滤膜技术和HPLC技术进行分离提取,应用生物传感器进行活性追踪监测,收集能与Lipid A结合的组分,并对其进行针对LPS的体内外生物学活性评估。对活性明确的有效组分,用HPLC作进一步的分离纯化,选择与Lipid A具有较高结合活性的HPLC产物作进一步的研究,对所得单体化合物进行纯度分析和结构解析。 2.对得到的单体化合物进行针对细菌脓毒症的体内外生物学活性评价,包括:①鲎试剂法检测单体对LPS的体内外中和作用;②ELISA法检测单体对LPS刺激巨噬细胞产生细胞因子(TNF-α和IL-6)的抑制作用;③RT-PCR法检测单体对LPS诱导巨噬细胞TLR4和TNF-αmRNA表达的影响;④观察单体化合物对脓毒症模型小鼠的保护作用。 结果 1.应用生物传感器技术平台,从60种中药中筛选出黄芩、胡连、赤芍、五倍子、诃子等5种具有与Lipid A较高结合活性的中药(RU200 arc seconds)。以黄芩为研究对象,从黄芩水提液中分离出与Lipid A具有结合活性的组分SbG-4;SbG-4 (40mg/kg)能显著提高热灭活大肠埃希氏菌攻击小鼠72h的存活率;物质属性鉴定SbG-4为黄酮类物质。应用膜分离技术从SbG-4中分离出分子量小于5000Da的5KL,5KL经HPLC分离获得5个HPLC组分(5KL-1~5);在5个组分中,以5KL-1与Lipid A的结合活性最高;在体外5KL-1对LPS具有直接中和作用、可显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞释放TNF-α,体内评价显示5KL-1对脓毒症模型小鼠具有显著的保护作用;5KL-1经HPLC进一步分离后,得到5KL-1A、5KL-1B和5KL-1C三个产物;其中仅5KL-1B是单一物质并与Lipid A的结合活性最高,纯度分析显示,5KL-1B的纯度因子为999.685;经质谱、核磁、红外等波谱分析,对5KL-1B的结构指认为2’, 5, 6’, 7-四羟基二氢黄酮醇(2’, 5, 6’, 7-tetrahydroxy-flavanonol, THF),分子式为:C15H12O7。 2.对THF的活性研究显示:①、THF在体内外对LPS均具有直接中和作用;②、THF能够显著抑制LPS诱导RAW264.7细胞释放TNF-α和IL-6,并具有明显的量效关系;③、THF对LPS诱导的RAW264.7细胞TLR4和TNF-α在mRNA水平的表达均具有显著的抑制作用;④、THF对致死剂量热灭活大肠埃希氏菌攻击的小鼠具有显著的保护作用。 结论 应用现代生物技术从黄芩中定向分离出2’, 5, 6’, 7-四羟基二氢黄酮醇;2’, 5, 6’, 7-四羟基二氢黄酮醇在体内外对LPS均具有拮抗作用,对脓毒症模型小鼠具有保护作用。


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