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RNA干扰抑制结缔组织生长因子对瘢痕疙瘩成纤维细胞功能影响的研究

赵平  
【摘要】: 瘢痕疙瘩是皮肤损伤如创伤、烧伤或手术后引发的过度纤维化。病变常蔓延至正常皮肤,严重损害容貌外观,造成功能障碍,不发生退行变化和单纯手术切除后极易复发。临床上治疗方法虽然很多,但疗效不佳。 CTGF是一种重要的促纤维化因子,通过SMADs途径参与病理性瘢痕的形成,阻断CTGF的产生及其促纤维化效应可能为今后病理性瘢痕的治疗提供了一个新的靶点。有研究报道,利用CTGF反义寡核苷酸能够抑制HKFs的增殖、CTGF蛋白质和mRNA的表达、胶原合成。 RNA干扰是利用与目的mRNA具有同源性的siRNA诱发序列特异性的转录后基因沉默的现象,它产生类似于“基因敲除”的生物表型,能够高效、特异地抑制靶基因。有报道能够代替基因打靶技术,应用于临床治疗相关疾病。 目的运用生物信息学方法,构建CTGFsiRNA干扰质粒,转染细胞后诱发RNAi,观察其对人瘢痕疙瘩成纤维细胞CTGF表达和胶原蛋白分泌的影响,并探讨其机制,为瘢痕疙瘩的基因治疗提供了一条新的思路。 方法根据RNAi设计原则,运用生物信息学方法,筛选出3条靶序列,分别合成3对64nt寡核苷酸,另以一条同样GC比例的错乱序列作为阴性对照,经与BamHI和HindIII酶切的线性化质粒pGenesil-1定向连接后转化大肠杆菌DH5a,质粒分别命名为pGenesil-CTGF1、pGenesil-CTGF2、pGenesil-CTGF3,pGenesil-CTGF4。质粒扩增后经酶切、测序鉴定。 为提高转染效率,使用Roche公司的Dosper脂质体进行转染,转染筛选实验分为六组:对照组(单纯DMEM培养基+脂质体);空质粒组(转染pGenesil-1空质粒);pGenesil-CTGF1组;pGenesil-CTGF2组;pGenesil-CTGF3组;pGenesil-CTGF4组。细胞经G-418筛选后,得到细胞克隆,逐步扩大培养。 使用荧光定量PCR检测各组细胞中CTGF mRNA水平、Western blotting半定量检测CTGF蛋白水平、H3-脯氨酸渗入法检测胶原蛋白含量。 分别用10ng/ml剂量TGF-β1刺激抑制效率最高的干扰质粒组细胞和未经转染的瘢痕疙瘩成纤维细胞,观察从形态学、CTGF mRNA、CTGF蛋白和胶原蛋白含量方面观察对细胞生物学的影响。 结果1.成功构建CTGF基因的siRNA表达质粒,测序证实插入序列正确。2.转染pGenesil-CTGF1、pGenesil-CTGF2干扰质粒的瘢痕疙瘩成纤维细胞CTGF mRNA表达水平的抑制效率分别是59.9%、20.4%(P0.05),pGenesil-CTGF3干扰质粒的抑制效率明显不佳(9.09%),在前两组干扰质粒组中,尤以pGenesil-CTGF1组抑制效果最佳。pGenesil-CTGF1干扰质粒对CTGF蛋白和胶原蛋白的抑制率分别达33.6%和49.7%(P0.05)。这说明构建siRNA干扰质粒可有效抑制相应基因和蛋白的表达水平,其抑制效果的差异与靶序列有关。 3.经TGF-β1刺激后,发现瘢痕疙瘩成纤维细胞的CTGF mRNA水平明显升高2倍多,但转染了pGenesil-CTGF1干扰质粒的细胞虽经TGF-β1刺激,CTGFmRNA水平也只有未经刺激细胞的56.6%,与刺激后的正常细胞相比明显降低(P0.05),CTGF蛋白水平、胶原蛋白含量与刺激后相比也明显降低33.6%、49.7%(P0.05)。 结论1.针对CTGF基因的siRNA干扰质粒转染瘢痕疙瘩成纤维细胞后能明显抑制CTGF mRNA表达,降低CTGF蛋白含量,提示该基因可作为基因治疗的靶点; 2.针对CTGF基因不同位点的siRNA干扰质粒转染细胞后,能够不同程度地抑制CTGF基因表达,其抑制效果和靶序列的位置有关; 3.经TGF-β1刺激后,转染pGenesil-CTGF干扰质粒的瘢痕疙瘩成纤维细胞CTGF mRNA、CTGF蛋白和胶原蛋白含量与与未经转染细胞相比明显降低,但与未经刺激的细胞相比,仍未到基线水平,说明TGF-β1是通过CTGF部分调节了细胞胶原代谢。


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