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豚鼠肝外胆道系统运动调控机制及其与胆结石的相关性研究

黄悦  
【摘要】: Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICCs)是西班牙神经解剖学家Santiago Ramon y Cajal在1893年应用甲基蓝和镀银染色,在豚鼠和家兔小肠描述的一种细胞。100多年来,学者们通过对胃肠壁内ICCs的形态、超微结构、起源以及生理功能等一系列的研究,初步明确ICCs是一种特殊的间质细胞,以细胞网络的形式分布于整个胃肠道。它能产生自发性电慢波、参与神经信号的整合与传递,对胃肠平滑肌节律性运动具有重要调控作用。近年研究发现,除胃肠道外,其它一些具有自主节律性的器官或组织,也存在类似ICCs的细胞,称Cajal样细胞,受到学者的关注,成为新的研究热点。 与胃肠平滑肌相似,胆道平滑肌也存在自发节律性运动,但其调控机制并不清楚。新近研究表明,人的正常胆囊、胆囊癌组织和壶腹均存在Cajal样细胞,可能与产生自发节律性电活动有关,对胆道系统的运动功能、正常压力的维持以及防止胆汁返流等具有重要调节作用,但目前对于Cajal样细胞在胆道系统的详细分布、形态特征、功能以及调控因素研究尚不完全清楚。据报道一氧化氮(nitric oxide,NO)对胃肠平滑肌的抑制作用是通过调节ICCs细胞的功能实现的,那么NO对Oddi括约肌运动的抑制作用是否通过Cajal样细胞介导有必要进一步研究。阐明这一问题,对于深入理解胆道系统运动功能调控机制及其与相关疾病的关系具有重要指导意义。胆结石是胆道系统临床上常见的疾病之一,目前对于它的病因和发病机制并不清楚,但多数研究表明胆囊运动功能减弱在胆石形成过程中起重要作用。鉴于Cajal样细胞在胆道系统运动调控中的重要性,那么在胆石形成过程中,Cajal样细胞的分布、形态功能变化等将是一个非常有趣的问题。 因此,本实验应用KIT蛋白特异性抗体,进行免疫组化和免疫荧光染色、NADPH-d组织化学方法和肌电活动记录等技术,结合分层铺片和冰冻切片,对豚鼠肝外胆道系统包括胆囊、胆囊管、肝总管、胆总管、十二指肠壶腹、Oddi括约肌(sphincter of Oddi)等部位Cajal样细胞的形态和分布、胆道系统NO神经分布以及与胆结石形成的相关性等,进行较详细的研究,期望本研究能为深入理解胆道系统自主节律性运动调控机制以及与胆结石形成的相关性等提供新的实验依据。 主要材料和方法: 1.应用KIT蛋白特异性抗体(ACK2)对胆道各部位的全层铺片或冰冻切片进行免疫组化和免疫荧光染色,显示Cajal样细胞的形态、分布,并对细胞数量进行计数和统计学分析比较。 2.采用针刺电极或粘膜接触电极分别记录SO、胆总管和胆囊的肌电活动,分别对其频率和波幅进行统计分析。 3. NADPH-d组织化学与c-kit免疫细胞化学双重染色显示NO神经与Cajal样细胞的相关性。 4.通过喂养致胆石饲料建立豚鼠胆结石模型,比较分析胆道Cajal样细胞及肌电活动的变化与结石形成的相关性。 主要结果如下: 一、豚鼠肝外胆道系统Cajal样细胞的形态和分布 1.全层铺片和切片均可见Cajal样细胞存在于整个肝外胆道。在肝管、胆囊管和胆囊,Cajal样细胞主要位于肌层,细胞呈梭形,有两个较短突起,无分支。在胆总管的上段,Cajal样细胞仅见环行排列,接近中段出现纵行平滑肌的同时,逐渐出现纵行的Cajal样细胞,分布在环纵平滑肌之间和肌层内。从胆总管上段至下段,细胞数量逐渐增多,突起逐渐伸长。肌内的Cajal样细胞呈长梭行,有两个突起;而环纵肌层间的细胞常呈星型,接近壶腹附近的细胞突起相互连接成网络状。上述结果表明豚鼠整个胆道系统均存在Cajal样细胞,为胆道系统自主节律运动的调控提供了新的形态学基础。 2.壶腹部位的胆总管分为外侧壁和内侧壁,均可见Cajal样细胞。外侧壁的Cajal样细胞体呈椭圆形或者三角形,突起常有1-3个分支或三个以上,相互连接形成细胞网络,与十二指肠肌间神经丛周围ICC相似。在外侧壁环肌的内面Cajal样细胞与十二指肠深肌丛附近的ICC相似。壶腹内侧壁肌层内可见大量的Cajal样细胞,与平滑肌细胞平行分布。於壶腹开口处, Cajal样细胞围绕开口形成一个密集的细胞环,而紧邻壶腹开口部位,Cajal样细胞排列成环行和纵行。Cajal样细胞数量的逐渐增多和形态的多样性,提示可能与该部位的复杂生理功能调控有关。 二、豚鼠胆囊、胆总管和Oddi括约肌的肌电活动 1.在壶腹、胆总管和胆囊均可记录到肌电活动,表现为峰电位活动波,波形有较好的一致性,多为双向波,且三者峰电位的频率相同,但波幅以壶腹最大,胆总管次之,胆囊最小。 2.在kreb-ringer液中加入药物硝普钠(NO供体),峰电位活动频率和波幅显著降低并迅速消失,提示NO对Cajal样细胞的活动具有明显的抑制作用。 三、豚鼠肝外胆道系统Cajal样细胞与NOS神经分布模式 1. NADPH-d组化染色可见NOS阳性神经分布于整个肝外胆道系统;在肝管、胆囊、胆囊管和胆总管上段,NOS阳性神经纤维较稀疏,散在分布,主要位于肌内;而在胆总管下段和壶腹处,NOS阳性神经纤维较密集,广泛分于肌间神经丛和肌内,以肌间神经丛最丰富,构成该神经丛的组成部分。 2. NADPH-d组织化学与c-kit免疫细胞化学双重染色可见NOS神经纤维和Cajal样细胞在壶腹部位肌间神经丛各自形成独立的网络,未见二者有共存现象,但二者间的距离较近,部分膨体样终末分布在Cajal样细胞的胞体和突起周围,可能为NO调控Cajal样细胞功能的结构基础。 四、胆结石模型豚鼠Cajal细胞形态及胆道肌电活动的研究 在胆固醇结石的豚鼠胆囊和胆道系统未见Cajal样细胞的形态和数量有明显改变,但胆囊和SO肌电活动峰电位波幅和频率较正常对照组明显低,具有显著性差异,是否与胆固醇直接或间接抑制Cajal样细胞或平滑肌细胞的功能有关有待今后研究。


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