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谷氨酰胺、甘氨酸及甘谷二肽对烧伤大鼠心肌保护作用及其信号机制的实验研究

吕尚军  
【摘要】: 背景: 近年来研究表明,烧伤早期即可出现严重的心肌损害,引发心源性休克。目前亦将其称之为“休克心”,它是烧伤最常见的并发症之一。由于心脏的特殊性,其损害不仅可引起心功能不全,还可诱发或加重休克,导致全身其它组织器官出现缺血缺氧性损害,从而引发烧伤后多器官功能不全,乃至多器官功能衰竭。因此在烧伤早期实施有效的心肌保护措施对于纠正休克,减轻脏器损害,减少内脏并发症的发生具有重要意义。目前临床上对烧伤后心肌损害的治疗主要以补液复苏和使用强心药物为主,虽在一定程度上改善了心肌功能,但存在增加心肌负荷的不足,有必要寻找新的心肌保护药物。 研究表明,谷氨酰胺(Glutamine,Gln)和甘氨酸(Glycine,Gly)对各种原因造成的心肌缺血缺氧性损害具有较好的保护作用,但谷氨酰胺溶解度低、热稳定性差,不能作为静脉制剂使用,使之在危重患者中的使用受到限制。以谷氨酰胺和甘氨酸为原料合成的甘氨酰-谷氨酰胺二肽(Glycyl-glutamine dipeptide,Gly-Gln,简称甘谷二肽)解决了这个问题。但目前尚未见甘谷二肽对心肌保护作用的报道,使用甘谷二肽是否能减轻烧伤后心肌细胞受损程度,改善心肌功能,以及谷氨酰胺和甘氨酸保护心肌细胞的机制,特别是其如何启动心肌细胞内源性保护的信号机制还不甚清楚。 目的: 本研究通过建立原代培养的乳鼠心肌细胞和大鼠烧伤损伤模型,观察谷氨酰胺、甘氨酸和甘谷二肽对烧伤后大鼠心肌的保护效应;探讨谷氨酰胺和甘氨酸启动心肌细胞内源性保护作用的信号机制。以期为甘谷二肽在烧伤临床的应用奠定理论基础,为烧伤患者心肌损害的救治提供新的治疗手段。 一、体内实验 方法: Wistar大鼠136只,体重200±20g,雌雄各半,由第三军医大学实验动物中心提供。大鼠单独饲养于动物实验室一周,保持温度和湿度恒定,自由进食水,实验前禁食12h。 1.动物分组和给药方式 大鼠随机分为正常对照组(C)、烧伤对照组(B)、谷氨酰胺组(Gln),甘氨酸组(Gly),甘谷二肽组(GG),除C组外每组设置时相点为烧伤后12、24、48、72小时,每组每时相8只大鼠。C组不予烧伤,其余4组采用10 g/L戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔麻醉,背部电推剃毛,称重后于剃毛区涂抹固体汽油燃烧18s,造成30%TBSAⅢ°烧伤(经病理切片证实),伤后腹腔注射乳酸林格氏液(50ml/kg)抗休克。Gln组给予谷氨酰胺1.0g/kg.d,Gly组给予甘氨酸0.5g/kg.d,GG组给予甘谷二肽1.5g/kg.d。为使各组大鼠等氮等热卡,采用补充酪氨酸的方法将各组总氨基酸供给量调整为1.5 g/kg.d。B、Gln和Gly组大鼠分别补充酪氨酸1.5、0.5和1.0g/kg.d。伤后大鼠单笼饲养,自由进食进水。 2.检测方法和指标 烧伤后12、24、48、72小时,检测心肌力学指标后取全血制备血清或血浆;处死大鼠迅速取心脏,切取部分组织福尔马林液固定;取心尖处约100mg组织,提取总蛋白;剩余心肌组织液氮保存备用。 (1)心肌组织HE染色,观察组织形态学变化。 (2)自动生化分析仪分析检测血清心肌酶谱(CK、LDH、AST)的变化。 (3)大鼠左心室插管连接四导生理记录仪,观察心肌力学指标(AOSP、AODP、LVSP、+dp/dt max)的变化。 (4)高效液相检测心肌组织高能磷酸化合物(AMP、ADP和ATP)含量。 (5)分光光度法检测心肌组织谷胱甘肽(GSH)含量和血浆乳酸(LD)含量。 (6)蛋白免疫印迹检测心肌组织HSP 70含量。 (7)免疫荧光检测心肌组织金属硫蛋白(MT)含量。 二、体外实验 方法: Wistar新生鼠(出生3天内)200只,雌雄不限,由第三军医大学实验动物中心提供。 1.原代心肌细胞培养和损伤模型 新生鼠全身酒精消毒,剖胸迅速取心脏,切取心尖2/3,冰PBS清洗,眼科剪将组织剪碎至1~3mm~3大小,采用胰酶消化分离心肌细胞,用含有10%胎牛血清和0.01MBrdU的DMEM培养基培养3天待用。用含10%制备的烧伤血清培养基培养心肌细胞,建立心肌细胞烧伤血清损伤模型。 2.细胞分组和检测指标: (1)心肌细胞随机分为对照组(C),烧伤组(B)和给药组(Gln组给予谷氨酰胺终浓度为12、16和20mmol/L;Gly组给予甘氨酸终浓度为0.8、1.2和1.6mmol/L)。10%烧伤血清损伤30min提取细胞总蛋白,采用蛋白免疫印迹技术检测mTOR及其下游底物P70 S6k和4E-BP1的磷酸化程度。 (2)细胞爬片随机分为对照组(C)、烧伤组(B)、给药组(Gln组谷氨酰胺终浓度为12mmol/L、Gly组甘氨酸终浓度为0.8mmol/L)和阻断剂组(Gln+R组和Gly+R组,阻断剂:终浓度为25ng/ml的雷帕霉素)。10%烧伤血清损伤1、3和6h,采用免疫荧光技术半定量检测心肌细胞HSP 70和MT含量及微管形态的变化。 结果: 1.烧伤后各组大鼠心肌酶谱均升高,CK、LDH于12h上升至最高,AST于24h上升至最高,随后下降;给药组各时相酶谱上升程度明显低于烧伤组,甘谷二肽效果优于谷氨酰胺和甘氨酸。 2.烧伤组大鼠损伤12h后心肌间质水肿,肌纤维紊乱;24h水肿加剧;48h~72h肌纤维溶解断裂,胞核消失。使用谷氨酰胺,甘氨酸和甘谷二肽能不同程度减轻心肌病理损害。 3.烧伤后心肌力学指标(AOSP、AODP、LVSP、+dp/dt max)均不同程度下降,72h降至最低,给药组心肌力学指标下降幅度明显低于烧伤对照组,甘谷二肽效果优于谷氨酰胺和甘氨酸。 4.烧伤后各组ATP、EC 72h下降至最低,ADP、AMP 12h升至最高;各给药组ATP和EC明显高于烧伤对照组,甘谷二肽效果优于谷氨酰胺和甘氨酸。 5.烧伤后各组GSH含量72h降至最低,谷氨酰胺、甘氨酸和甘谷二肽组GSH含量明显高于烧伤对照组,各组比较甘谷二肽组疗效最明显。 6.正常组织中含有少量MT,烧伤后MT合成有所增加,在伤后72h最高,各给药组心肌组织MT含量明显高于烧伤对照组;正常组织中只含有微量HSP 70,烧伤后HSP 70含量一过性增加。各给药组HSP 70含量明显高于烧伤对照组,各组比较甘谷二肽组疗效最明显。 7.不同浓度的谷氨酰胺和甘氨酸均能显著增加mTOR及其下游信号分子P70 S6k磷酸化程度;谷氨酰胺和甘氨酸分别在12mmol/L和0.8mmol/L时促进4E-BP1磷酸化的作用最明显,超过该浓度促磷酸化作用有所减弱。 8.正常细胞含有微量HSP 70和MT,烧伤血清损伤后其蛋白含量有所增加,使用谷氨酰胺和甘氨酸能够促进HSP 70和MT蛋白合成,在孵育6h时蛋白含量最高。使用雷帕霉素能够阻断谷氨酰胺和甘氨酸促进HSP 70和MT合成的生物效应。 9.对照组心肌细胞微管结构完整,呈网格排列,染色均匀。烧伤损伤1h微管出现断裂,染色不均一;3h部分微管明显缺失,6h微管结构模糊不清。谷氨酰胺和甘氨酸能明显降低微管受损程度,使用雷帕霉素能阻断谷氨酰胺和甘氨酸对微管的保护作用。 结论: 谷氨酰胺、甘氨酸和甘谷二肽能有效降低烧伤后心肌受损程度,具有很好的心肌保护作用。甘谷二肽的疗效优于谷氨酰胺和甘氨酸单独给药,提示谷氨酰胺和甘氨酸的保护效应具有协同作用。谷氨酰胺、甘氨酸的作用机制如下: 1.谷氨酰胺和甘氨酸能够改善心肌能量代谢,促进ATP合成,增加细胞生物能量储备。 2.谷氨酰胺和甘氨酸能够促进谷胱甘肽和金属硫蛋白合成,减少自由基生成,减轻心肌细胞脂质过氧化损害,维护细胞正常的能量代谢。 3.谷氨酰胺和甘氨酸能够促进心肌细胞HSP 70合成,防止蛋白变性,促进受损蛋白复性,减轻烧伤后心肌细胞受损程度。 4.谷氨酰胺和甘氨酸通过mTOR信号途经调控心肌细胞HSP 70和MT的蛋白翻译过程,促进蛋白合成。


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