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超声微泡介导转染FKBP12.6基因对心衰犬心功能及心肌病理的影响

王逵  
【摘要】: 背景和目的:研究发现,多种病理状态下的心肌细胞特征性地表现为兴奋-收缩耦联的诸多异常。2型雷尼丁受体(RyR2)是肌浆网(SR)上钙释放通道,心衰时RyR2通道缺陷造成心肌舒缩功能障碍及心律失常等问题,而FK506结合蛋白12.6(KBP12.6)的蛋白水平及其与RyR2受体的亲和力下降是RyR2通道缺陷的一个重要原因。体外研究表明,FKBP12.6过表达可以纠正RyR2通道缺陷,减少Ca2+外漏,增加Ca2+瞬变,提高胞浆Ca2+浓度,增强心肌收缩,因此有可能作为治疗心肌功能异常的靶标。超声造影技术的不断发展和可携带基因的微泡声学造影剂的研制,使得超声已经从一种临床诊断工具,进入到治疗领域。超声波破坏含靶基因的微泡造影剂定位释放技术,是一种新型的基因定向转染技术,该技术使用的微泡直径小于8μm,含基因表达载体,微泡通过肺循环到达相应组织后,利用诊断超声增加特定组织的微血管通透性,使靶基因可通过微血管和内皮细胞间隙到达实质细胞内。国外的研究结果表明,超声波破坏微泡可使基因的转染效率和表达明显提高。 本课题通过快速起搏造成犬心衰后,将携带pcDNA3.1- FKBP12.6的超声微泡造影剂经导管注入右室,应用诊断超声定向转染心肌,观察FKBP12.6基因转染对犬心脏形态结构、心功能及心肌病理变化等的影响,探讨FKBP12.6过表达改善心衰时心肌舒缩功能的可行性,进而为探索安全、高效的治疗心肌功能异常提供新的途径。 方法:28只快速起搏心衰犬随机分为4组。转染组以白蛋白微泡为载体,在超声破坏下将人工合成的pcDNA3.1-FKBP12.6质粒转染入心肌中,转染后分别观察4天(transfectionⅠ)或14天(transfectionⅡ),以不含质粒的微泡作为对照组。分别在起搏器安置前、转染前、转染后,起搏器关闭状态下通过超声和有创血流动力学检查测定左室内径和心功能,同时检测血浆心钠肽(ANP)、脑钠肽(BNP)。评价FKBP12.6基因对心衰的治疗效果。通过HE染色和透射电镜观察心肌病理变化。应用RT-PCR检测各组FKBP12.6基因的表达情况。 结果: 1.转染组EF、FS在第4天可见明显好转,并在14天时保持稳定,但一直低于正常水平。在第4天时转染组LVEDD与对照组无变化,而LVEDV下降(p=0.04),在14天时两指标与对照组比较均缩小(LVEDD和LVEDV的p值分别为0.012和0.005)。 2.心衰时各组RAP、mRVP、mPAP、PAWP与基础值相比均增高,CO(cardiac output)则下降(P均0.01),各组间无差异。在观察终点,转染组RAP、mRVP、mPAP、PAWP接近正常水平,CO虽明显增加,但仍未及正常水平,两转染组之间各指标保持稳定。两对照组转染后各指标基本不变,controlⅡ组CO较转染前降低,但未达到统计学意义(P=0.279) 3.心衰时各组ANP、BNP急剧上升,较起搏前p值均小于0.01。转染组心功能好转后ANP和BNP迅速下降接近正常,与对照组及转染前均差异显著。而两对照组ANP和BNP较转染前稍有增加,但不显著。对照组之间及转染组之间比较,ANP和BNP无差异(表3)。 4.转染4d时,FKBP12.6 mRNA表达明显升高,与β-actin比值(2.80±0.33)约为对照组的3.4倍,随着时间的延长,FKBP12.6 mRNA表达降低,在14d时与β-actin比值(1.30±0.20)不及4d时的1/2。而controlⅡ组较controlⅠ组FKBP12.6 mRNA表达略有下降,但无差异(0.75±0.17vs0.83±0.19)。 5.心肌病理显示转染组病变轻于对照组,而且未转染组病变进一步恶化。转染4天时,心肌细胞及间质水肿明显减轻,红细胞渗出减少,超微结果显示线粒体水肿减轻;对照组心肌病理进一步恶化,14天时较4天时水肿更明显,并有细胞排列明显紊乱,线粒体出现空泡化。 结论:通过超声触发微泡破裂转染FKBP12.6基因至心衰犬心肌中,我们得出以下结论: 1.超声触发微泡破裂转染FKBP12.6基因可在心肌细胞高效表达; 2.超声微泡介导FKBP12.6基因转染心肌细胞,可以明显改善心肌细胞的结构和功能,为今后探索安全、高效的心肌功能异常的治疗提供了新的思路。


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