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CCN1基因腺病毒在放创复合伤修复中的作用和机理研究

杜业军  
【摘要】: 一、目的 放创复合伤是战时核爆炸和平时核事故中所发生的主要伤型之一,损伤后其伤口愈合主要表现为愈合延迟,甚至长期不愈合。CCN1(Cysteine rich 61,Cyr61/CCN1)是即刻早期基因CCN家族成员,体外研究显示其能促进细胞黏附、增殖、迁移,调节血管生成,影响基质代谢,参与创伤修复,关于CCN1在放创复合伤愈合中的作用尚未见报道。本课题检测CCN1蛋白和mRNA在大鼠放创复合伤创面肉芽组织的表达情况;构建重组腺病毒AdCCN1感染创面组织后促进创伤愈合以及对创伤修复相关因子的表达调控。通过研究,探讨CCN1在放创复合伤愈合中的作用及机制。为深入认识伤口愈合过程的机制提供新的视角,并为探索促愈治疗新药提供新的途径。 二、方法和结果 1.放创复合伤大鼠模型的建立及CCN1在创面组织中的表达和意义:将大鼠随机分为单纯创伤组和放创复合伤组。放创复合伤组采用60Coγ射线进行全身照射在照射后1h内,制背部皮肤全层切除伤口。在伤后的第0、3、6、9、15、21d取材,用RT-PCR和免疫组织化学染色分别检测CCN1 mRNA和蛋白的表达水平,发现在伤后约15d之前CCN1蛋白和mRNA较单纯创伤表达下降,约21d时表达量升高。CCN1的表达较单纯创伤组延迟。 2. CCN1腺病毒的构建、制备及其活性检测:通过酶切连接的方式将pCMV-CCN1中的小鼠CCN1表达框连入pAdTrace-TO4穿梭载体中获得pAdTrace-CCN1,线性化后在AdEasy-1大肠杆菌中进行同源重组,获得pAdCCN1重组腺病毒质粒,随后线性化转染293细胞进行病毒颗粒包装。收集病毒裂解液并反复感染293细胞扩增病毒后感染创面CHO细胞和创面组织细胞,用Western Blot和IHC鉴定CCN1在CHO细胞中正确分泌,并且在创面组织细胞中高表达。 3.CCN1重组腺病毒在放创复合伤修复中的作用及其机理的实验研究:致伤后,立即在创面边缘分别皮下注射等量AdCCN1病毒和AdRFP病毒,7天后取材固定制作石蜡切片,HE染色表明AdCCN1组创面,成纤维细胞增多,微血管密度增高, IHC检测MMP1、TIMP1、bFGF等创伤愈合相关因子表达均升高。 三、结论 1.建立了放创复合伤大鼠模型,检测到创面肉芽组织中在伤后约15d之前CCN1蛋白和mRNA较单纯创伤表达下降,约21d时表达量升高。CCN1的表达下降可能是放创复合伤难愈的原因之一。 2.应用AdEasy系统构建、制备AdCCN1重组腺病毒,酶切鉴定结果与预期相符;发现其可以感染CHO细胞正确分泌CCN1;可以有效感染创面组织细胞,并可使其高表达CCN1。 3.AdCCN1在放创复合伤愈合中的作用机理可能在于:AdCCN1感染创面组织细胞高表达分泌CCN1后,通过提高MMP1、TIMP1、bFGF等创伤愈合相关因子的表达发挥作用。


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