NOTCH-1信号通路对脑胶质瘤干细胞增殖与分化调控作用的实验研究

【摘要】： 胶质瘤是常见的一种原发于神经系统的恶性肿瘤,是治疗效果最差的肿瘤之一。最大的难点在于复发,这与胶质瘤细胞的无限增殖能力和侵袭性生长有关。近期发现脑胶质瘤中存在胶质瘤干细胞,但仅占细胞成分中的少部分。它具有能自我更新和增殖、分化能力,是形成不同分化程度胶质瘤细胞的“种子”细胞,在胶质瘤的发生、发展和复发中起决定性作用。 近年来通过对NOTCH-1信号通路的深入研究,发现NOTCH-1信号的异常与人类肿瘤形成有密切的联系。在多种组织肿瘤中均发现NOTCH-1信号通路的异常激活。中枢神经系统中NOTCH-1信号通路的异常激活可能导致脑肿瘤形成。NOTCH-1信号通路在脑胶质瘤的发生中起重要作用,一些胶质瘤和髓母细胞瘤以及相应的模型系统的维持和存活需要NOTCH-1信号通路信号;NOTCH-1信号通路可能参与了胶质瘤的启动,而且通常作用于神经前体细胞或有神经干细胞特性的细胞。NOTCH信号通路通过NOTCH-HES信号转导系统抑制神经干细胞分化为神经细胞和胶质细胞,从而间接维持神经干细胞的未分化状态和自我更新。在此过程中发挥关键的作用的是碱性螺旋-环-螺旋( basic-helix-loop-helix, bHLH)基因。NOTCH-1信号也可通过细胞周期因子、抗凋亡因子调控,或与其他信号通路如SHH通路协同,发挥调控作用,从而影响肿瘤细胞的增殖和存活。 鉴于NOTCH-1信号通路在NSC或神经前体细胞的自我更新、增殖及分化中起重要作用,而在包括髓母细胞瘤在内的胶质瘤和其它多种肿瘤组织及细胞系中也发现NOTCH-1信号通路的异常活化,我们推测在胶质瘤的种子细胞胶质瘤干细胞中应该也有NOTCH-1信号的异常变化,并可能对胶质瘤的发生、发展起重要作用,但是究竟如何变化?这些变化又是通过何种机制决定胶质瘤干细胞的命运及调控其增殖、分化等生物学行为?目前国内外尚未见报导,值得进一步深入研究。 在第一部分实验中,采用以CD133为标志,用免疫磁珠法从人脑胶质瘤组织和细胞株中分离脑胶质瘤干细胞并进行体外培养,通过免疫荧光技术检测干细胞标志物CD133、Nestin,诱导分化后检查分化细胞标志物MAP2、GFAP、MBP以及电镜超微结构观察和移植SCID鼠致瘤实验,对其干细胞特性加以鉴定,得到如下结果: 不同病理分级的新鲜胶质瘤标本和胶质瘤细胞株中存在一小部分CD133+的胶质瘤细胞,能表达干细胞的标志物CD133和Nestin,符合干细胞的超微结构特点,体外培养能连续传代;具有多向分化潜能:诱导分化后能产生MAP2、β-TubulinⅢ、GFAP、MBP染色阳性的细胞;移植SCID鼠后能形成与亲本肿瘤表型一致的移植瘤。因此,这一小部分CD133+胶质瘤细胞具有干细胞的属性,就是胶质瘤中的肿瘤干细胞,即胶质瘤干细胞。 在第二部分实验中,采用体外分离培养的胶质瘤干细胞作为细胞模型,研究胶质瘤干细胞增殖、分化培养过程中NOTCH-1信号通路基因和蛋白的表达情况,以及脑胶质瘤组织和细胞株中的蛋白表达情况及细胞类型,并分析与脑胶质瘤干细胞增殖、分化的关系。应用免疫荧光技术、RT-PCR、Western Blot和流式细胞术等检测对体外培养的脑胶质瘤干细胞增殖、分化、得到如下结果: 1、脑胶质瘤组织和细胞株中有NOTCH-1和HES-1表达,而正常成人脑组织中仅能检测到微弱的表达;NOTCH-1和HES-1在高级别胶质瘤组织中的表达强于低级别胶质瘤组织中。 2、NOTCH-1和HES-1在CD133、MAP2、GFAP和MBP阳性细胞中均可表达,但在CD133阳性细胞中有很强的表达,而在发育较成熟的MAP2、GFAP和MBP阳性细胞中表达减弱或极弱检测不到,提示NOTCH-1和HES-1的表达强弱可能参与了胶质瘤细胞未分化状态的维持和分化的调控。 3、胶质瘤干细胞增殖过程均能检测到较强的NOTCH-1信号通路基因mRNA和蛋白表达,提示NOTCH-1信号通路的强表达可能参与了脑胶质瘤干细胞增殖过程的调控和干细胞状态的维持。 4、胶质瘤干细胞分化时NOTCH-1信号通路基因mRNA和蛋白表达逐渐减弱,CD133表达逐渐减弱,MAP2、GFAP和MBP出现表达并逐渐增强,提示NOTCH-1信号通路表达减弱可能参与了胶质瘤干细胞分化的调控。 在第三部分实验中,在第二部分的基础上构建了针对人NOTCH-1基因的RNA干扰逆转录病毒载体,应用RNAi技术抑制脑胶质瘤干细胞中NOTCH-1信号通路的表达和作用,分析NOTCH-1信号通路对脑胶质瘤干细胞增殖与分化的调控作用,得到如下结果。 1、成功构建了pSiRNA- NOTCH-1和pSiRNA-NC,并经PT 67细胞包装后生成了相应的逆转录病毒载体。 2、对NOTCH-1信号通路进行RNAi后,胶质瘤干细胞增殖受到抑制,存活细胞减少;G0/G1期细胞减少,G2/M期细胞增加,凋亡/坏死细胞增加,提示NOTCH-1信号通路对胶质瘤干细胞增殖、细胞分裂和存活有促进作用,该作用可能是通过调控细胞周期以促进细胞分裂、减少细胞凋亡/坏死实现的。 3、对NOTCH-1信号通路RNAi后,脑胶质瘤干细胞分化受到抑制,死亡细胞明显增加,说明NOTCH-1信号通路促进胶质瘤干细胞分化和存活。 总之,通过本课题的研究,结果表明: NOTCH-1信号通路的基因和蛋白在脑胶质瘤的增殖、分化和存活的过程中同样表达并发挥重要的调控作用,不仅促进脑胶质瘤干细胞的增殖和存活,同样也促进并调控脑胶质瘤干细胞的分化过程和存活,该作用可能是通过调控细胞周期以促进细胞分裂、减少细胞凋亡、坏死实现的。 我们也应该看到,NOTCH-1信号仅仅是胶质瘤增殖、分化和存活中起关键作用的信号通路之一,其他的信号通路如、HH、WNT、EGF、bFGF信号通路可能也对胶质瘤增殖、分化和存活起着重要作用,因此,很可能是众多信号通路协同作用,共同完成对胶质瘤干细胞增殖分化和存活的综合调控作用。对这些关键因素的进一步研究,将使我们在更广、更深的层面上认识和理解调控胶质瘤发发病机制。