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RNA干扰抑制h POT1表达对人胃癌细胞生物学特性的影响

宁晓燕  
【摘要】: 目的:端粒是真核细胞线性染色体的末端结构,由简单的DNA重复序列和一系列相关的蛋白质组成。人类的衰老、肿瘤发生都和端粒功能失常有密切的关系,端维持正常的结构和功能有赖于众多端粒相关蛋白的存在。端粒保护蛋白POT1 (protection of telomeres 1 )是2001年首先在单核细胞中发现的,主要作用是保护端粒和调节端粒长度,目前关于POT1在胃癌细胞中的作用还研究甚少。我们通过RNA干扰技术,抑制人胃癌细胞BGC823中人端粒保护蛋白hPOT1(human protection of telomeres 1 )的表达,观察细胞生物学特性和端粒长度的变化,以及TRF1、TRF2、tankyrase,hTERT和突变型p53等相关基因表达水平的改变,了解hPOT1在人胃癌细胞中的作用及其机制。 方法:1、根据国外参考文献和RNA干扰序列的设计原则,从hPOT1编码区选取一段19个硷基的序列gtactagaagcctatctca为干扰序列,同时自行设计一段无关序列作为阴性对照(干扰序列和阴性对照序列经BLAST比对确认和人类的其他基因没有同源性)构建表达hPOT1的RNA干扰真核表达载体以及阴性对照载体。2、体外培养低分化人胃癌细胞BGC-823,利用脂质体进行基因转染,G418筛选转入外源基因并稳定表达的细胞。3、提取细胞总RNA,进行半定量RT-PCR扩增hPOT1,以β-actin为内参照,检测hPOT1表达水平,验证对hPOT1的干扰效果。4、细胞生物学特性的变化:通过HE染色观察细胞形态学改变;通过生长曲线、平板克隆形成实验,观察细胞的增殖和存活能力;通过β-半乳糖苷酶染色检测衰老;通过流式细胞仪检测细胞凋亡,通过荧光定量PCR的方法测定端粒长度的改变。5、通过半定量RT-PCR,检测TRF1、TRF2、tankyrase、hTERT和突变型p53等相关基因表达水平的改变。 结果:1、经DNA测序鉴定,hPOT1 RNA干扰载体和阴性对照载体分别包含干扰序列和阴性对照序列的插入片段,说明载体构建成功。2、经半定量RT-PCR鉴定, RNA干扰组的细胞hPOT表达水平明显下调,说明hPOT RNA干扰起到了抑制目的基因表达的作用。3、与亲本细胞和阴性对照细胞相比,干扰组细胞生物学特性发生一系列的变化:(1)细胞形态:细胞仍然呈多边形,但是大小不一更加明显,多核巨细胞更为常见。(2)细胞增殖率:明显减慢。(3)克隆形成能力:明显下降。(6孔板中每孔接种200个细胞,每组设三个复孔,2周后计算细胞数大于50个的细胞克隆:亲本细胞克隆数为:97.6±8.0个、阴性对照细胞为:96.0±5.28个、干扰组为:22.6±5.5个。干扰组细胞克隆数明显少于亲本细胞和阴性对照组,P0.05,亲本细胞和阴性对照组之间无明显差异)。(4)、衰老:出现较多染为蓝色的衰老细胞(将1×105个细胞接种于24孔板,每组设3个复孔,48小时后进行β-gal染色,8小时后普通相差显微镜下观察,干扰组每孔蓝染细胞数分别为:138个、154个、140个,平均每孔144个,而亲本细胞和阴性对照组每孔只有1-2个细胞出现极其微弱的染色)。(5)干扰组细胞凋亡率略有增加,但是无统计学意义。(6)端粒长度明显缩短(对应于端粒相对长度的T/S值为:干扰组T/S=2-2.035=0.2440,阴性对照组T/S=20.113=1.0815,亲本细胞组T/S=20.797=1.7375)。4、经RT-PCR半定量检测,干扰组TRF1表达明显上调,TRF2和tankyrase表达明显下调,hTERT表达水平没有明显改变,突变型p53表达略有下调。 结论:人胃癌细胞BGC823细胞经RNA干扰抑制hPOT1表达后:1、细胞多核化更加明显,巨细胞比例明显增多,出现衰老、增殖减墁、克隆形成能力下降、凋亡增加等一系列染色体不稳定的表现,提示hPOT1表达减少后,端粒失去有效的保护从而诱发染色体不稳定。2、RNA干扰后细胞端粒长度明显缩短,提示在人胃癌细胞BGC823中,hPOT1对端粒长度起正性调节的作用。3、在mRNA水平,TRF1表达明显上调,TRF2和tankyrase表达明显下调,hTERT表达水平无明显改变,突变型p53表达略有下调。提示(1) hPOT1和TRF1、TRF2、tankyrase具有较为密切的相关性,并且相互制约、相互影响,其中在端粒保护方面,hPOT1与TRF2具有相似的作用,在hPOT1表达下调时,TRF2也出现明显下调。在端粒长度调节方面,hPOT1正性调节端粒长度,TRF1负性调节端粒长度,两者具有相反的作用,在hPOT1表达下调时,TRF1出现明显上调;tankyrase正性调节端粒长度,与hPOT1具有相同的作用,在hPOT1表达下调时,tankyrase也出现明显下调。(2) hPOT1对端粒长度的调节不依赖于端粒酶活性。(3) hPOT1表达水平与突变型p53表达有一定相关性。


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