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肺炎克雷伯菌噬菌体的分离和生物学特性分析及体外杀菌实验

张红明  
【摘要】: 肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia,KPN)为临床常见革兰氏阴性杆菌,属于肠杆菌科( Enterobacteriaceae)克雷伯菌属( klebsiella)。该菌广泛分布于自然界,近年来成为仅次于大肠杆菌的最重要的条件致病菌,严重地危害着人类的健康和生命。噬菌体(Bacteriophage)是细菌的病毒,它与宿主菌关系密切。一方面,溶原性噬菌体通过自身携带的外源性遗传物质改变宿主菌的生物学性状,同时,在与宿主菌基因组不断的重组、整合、转座和切离过程中彼此交换遗传物质,影响宿主菌及自身基因的多样性。另一方面,裂解性噬菌体能特异性裂解宿主菌,如果诱导前噬菌体进入裂解性生长周期也可导致细菌裂解,噬菌体有望发展成为抗细菌感染的生物制剂。不断分离新的噬菌体和描述其基本的生物学特性是噬菌体研究人员的首要任务。 本研究以临床分离的肺炎克雷伯菌肺炎亚种为宿主菌,从处理前污水中成功分离出肺炎克雷伯菌的噬菌体,并对其基本的生物学特性进行了描述,最后对其体外杀菌能力进行了评估。本研究主要的研究内容及实验结果包括以下几个方面: 1.以肺炎克雷伯菌临床分离株为宿主菌,从医院污水处理站处理前污水中成分离出肺炎克雷伯菌噬菌体一株,并命名为KPNP1。噬菌体KPNP1形成的噬斑较大,圆形,直径约4~7 mm,透明,表现为裂解性噬菌体的噬斑特征,滴度测定其滴度为6.1×1011 PFU/ml。电镜下可见噬菌体KPNP1有一个多面体立体对称的头部,头部直径约为180 nm,无囊膜,有一长尾,尾长约210 nm,尾宽约30 nm,属于长尾噬菌体科。 2.感染复数(multiplicity of infection, MOI)是指噬菌体感染宿主菌时噬菌体数量与宿主菌数量的比值,也称感染倍数。最佳感染复数是噬菌体与宿主菌作用所能产生最佳效果时噬菌体数量与宿主菌数量的比值,本实验KPNP1感染其宿主的最佳感染复数为4。 3.一步生长实验表明:KPNP1在37℃温育条件下,15min内吸附宿主菌的百分率为72%。感染宿主菌的潜伏期约为35 min ,裂解期约为40 min,裂解量为94 PFU/cell。 4.丝裂酶素C诱导法和紫外线诱导法处理可疑溶原性细菌后均不能形成噬斑,说明KPNP1为非溶原性噬菌体,而是裂解性噬菌体。 5. KPNP1的宿主谱比较窄,仅对少量(1/30)肺炎克雷伯菌肺炎亚种敏感,对部分大肠埃希菌也敏感。 6.体外杀菌试验表明KPNP1对KPN悬液的杀菌作用明显,噬菌体浓度在1.8×1010 PFU/ml时,反应达100分钟时的杀灭有效率为81.1%,噬菌体浓度在1.8×109PFU/ml时,反应达100分钟时的杀灭有效率为82.3%,而低浓度噬菌体液随着时间的延长也能达到相同的杀菌效果。 7.以泌尿管外科常用硅橡胶导尿管为材料,成功构建出耐药KPN的生物膜,并对形成的生物膜用KPNP1处理2小时,结果表明:KPNP1对导尿管KPN生物膜的杀菌作用较明显,杀菌有效率为71.8%,电镜观察也显示KPNP1作用前导尿管上KPN细菌生长旺盛,细菌聚团生长现象明显;KPNP1作用2小时后可见细菌显著减少,细菌生长稀少,少见聚团生长。


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