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特异上调HO-1基因表达的人工转录因子构建

郭洪峰  
【摘要】: 研究背景及目的 血红素加氧酶-1(Heme Oxygenase, HO-1)是血红素分解代谢的关键酶,反应底物是血红素,产物分别是CO、游离Fe和胆绿素。随后游离Fe与转铁蛋白结合,胆绿素在胆绿素还原酶的作用下生成胆红素。研究发现HO-1是一种心血管保护因子,可通过直接分解血红素和生成具有抗炎、抗氧化、抗凋亡及细胞信号传导特性的代谢产物发挥细胞、组织保护作用。特异上调HO-1基因的表达可为心血管疾病的防治提供一个新策略,人工转录因子(artificial transcription factor, ATF)技术可用于实现这个目的。 转录因子由DNA结合结构域(DNA-binding domain, DBD)和效应结构域(activation domain, AD)构成,前者是决定转录因子基因调控靶向性的关键,因此构建人工转录因子的关键在于DNA结合结构域的设计。锌指蛋白(zinc finger protein, ZFP)是天然转录因子中常见的DNA结合结构域。由于与DNA靶序列的结合具有模块化特点,锌指蛋白是目前构建人工转录因子最常用的DNA结合结构域。 本研究旨在设计一种可特异识别HO-1增强子的锌指蛋白,并基于该蛋白构建一种可特异上调HO-1基因表达的人工转录因子,进一步通过相关实验分析探讨其活性。 研究方法 1、查阅文献,了解HO-1基因的转录调控机制。 2、在HO-1基因增强子上确定锌指蛋白靶序列的初筛范围,将该范围包括的DNA序列提交在线锌指蛋白设计软件ZF Tools 3.0,筛选最佳靶序列及与其对应的锌指蛋白氨基酸序列。 3、通过Swiss Model对锌指蛋白的结构特征进行评估。 4、将锌指蛋白编码序列提交公司合成并克隆到载体PUC57上,记为PUC57-ZFP;本实验室保存的载体pcDNA3.1-NLS-eGFP-p65-flag带有p65功能区(用作人工转录因子的效应结构域)及核定位信号(nuclear localization signal, NLS)的编码序列。通过这两种载体重组构建带有完整人工转录因子编码序列的载体pcDNA3.1-ZFP-p65-flag和pcDNA3.1-NLS-ZFP-p65-flag。 5、通过RT-PCR及免疫荧光检测两种人工转录因子表达载体在ECV304细胞中的表达情况。 6、通过双荧光素酶报告基因检测分析人工转录因子特异识别HO-1增强子的活性;通过实时荧光定量RT-PCR检测分析人工转录因子上调HO-1基因表达的活性。 实验结果 1、锌指蛋白靶序列的初筛范围是HO-1增强子3'端2个应激反应元件(stress- response element, StRE)之间一段长54bp的序列: 5'-TGTTTGGGAGGGGGGACTCGCGGAAACAAAGGGAAGGCGGATTTTGCTAGATTT-3'提交ZF Tools 3.0后筛选得到锌指蛋白的最佳靶序列为: 5'-ACT CGC GGA AAC AAA GGG-3'与此对应的锌指蛋白氨基酸序列为: N’-LEPGEKPYKCPECGKSFSRSDKLVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSQRANLRAHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSDSGNLRVHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSQRAHLERHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSHTGHLLEHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSTHLDLIRHQRTHTGKKTS-C’ 2、序列特征分析显示锌指蛋白含有6个锌指基序,分别位于其氨基酸序列的第8—30、36—58、64—86、92—114、120—142和148—170位。同源建模显示锌指蛋白在空间上形成6根指状结构,Anolea和Verify3D两种方法对建模结果的评估显示锌指蛋白的空间结构稳定。 3、免疫荧光及RT-PCR检测的结果说明两种人工转录因子表达载体在ECV304细胞中能正常表达。 4、双荧光素酶报告基因检测的结果显示,当萤火虫荧光素酶报告基因为hHO4.9luc(将HO-1基因调控序列克隆到pGL3-basic上得到)时,其表达随pcDNA3.1- ZFP-p65-flag转染用量的增加而升高,具有明显的量效关系。当pcDNA3.1-ZFP-p65-flag的转染用量为150ng时,报告基因的表达是基础表达的4.14倍。而用作对照的pcDNA3.1-nls-eGFP-p65-flag、PUC57-ZFP和pcDNA3.1-zfp-p65-flag(针对另外一种基因A20设计的人工转录因子)对报告基因表达的上调效果则不明显,且不具有明显的量效关系。当萤火虫荧光素酶报告基因为pGL3-Control时,4种载体对其表达的上调效果均不明显。说明人工转录因子具有特异识别HO-1增强子的活性,其上调报告基因表达的活性需要DNA结合结构域和效应结构域的协同。 5、实时荧光定量RT-PCR检测结果显示,HO-1基因的表达随pcDNA3.1-NLS-ZFP-p65-flag转染用量的增加而升高,具有明显的量效关系。当pcDNA3.1-NLS-ZFP- p65-flag的转染用量为200ng时,HO-1基因的表达是基础表达的7.95倍。而用作对照的pcDNA3.1-ZFP-p65-flag对HO-1基因表达的上调效果则不明显,且不具有明显的量效关系。说明人工转录因子具有上调HO-1基因表达的活性,NLS在介导人工转录因子进入细胞核的过程中发挥了重要作用。 结论 1、本研究利用生物信息学的方法设计得到了一种可特异识别HO-1增强子的锌指蛋白。 2、基于该锌指蛋白构建了一种可特异上调HO-1基因表达的人工转录因子,实验证明该人工转录因子在ECV304细胞内能正常表达,且具有特异识别HO-1增强子及上调HO-1基因表达的活性。 3、利用该人工转录因子特异上调HO-1基因的表达可作为一种有潜力的手段应用于心血管疾病的防治,也为调控其他疾病相关基因的表达提供了一种思路。


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