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布鲁氏菌噬菌体裂解酶基因表达、生物活性鉴定及裂菌动力学研究

朱才众  
【摘要】: 布鲁氏菌病是由布鲁氏菌(简称布氏菌)引起的人畜共患传染病,在我国被列为二类传染病。全世界170多个国家和地区每年向WHO报告发病例数50万例。在过去15年中,随着经济政策等多方面的发展,加之各地重视程度的不同,疫区有了新的变化,以致很多发达国家也有流行。在我国布病波及28个省市区,并且近年疫情反弹、死灰复燃,对畜牧经济带来巨大影响,以及对人类健康构成严重威胁。此外,布鲁氏菌是一种标准的生物战剂。由于其独特的生物特征(几个菌细胞即可造成感染)和损伤效应(可通过气溶胶感染并且形成胞内寄生),早在20世纪50年代布鲁氏菌即被美军列为B类标准生物战剂,从战略和战术上被敌对方使用的可能性很大,这对我国和我军的生物袭击防护能力提出了新的挑战,针对性开展生物防护成为军事医学的重要任务。虽然对布病的认识已经存在近千年,但是在病原体致病机制、流行病学理论与控制技术、治疗药物、疫苗等领域的研究起步尚晚。目前a.布鲁氏菌病畜用疫苗的安全性和有效性方面存在诸多局限性,而人用疫苗则至今没有一种安全、有效的产品;b.布病临床治疗时间长,耐药问题亦十分严峻。如果选用耐药菌进行生物恐怖袭击,防治工作将十分困难;c.生物袭击后大面积疫源地及疫区环境、物品洗消一般普遍采用高效的化学消毒剂进行处理,存在对物品、装备的高度刺激、腐蚀,引起环境污染、病原体抗力增加,生态平衡破坏,环境洗消技术同样亟待突破。因此基于上述三个因素,研制新一代安全、高效、价廉布鲁氏菌病药物成为我军乃至我国的生命科学重要课题。 噬菌体,作为细菌的病毒,能够特异性的感染和裂解细菌。早在上个世纪二十年代,人们首次引入噬菌体来治疗细菌的感染并取得了良好的效果。但随着抗生素时代的来临,这种治疗方法的发展被忽略。近年来各种耐药性菌株的大量出现,使人们再一次把目光集中到了噬菌体上,运用噬菌体,这种细菌的病毒来治疗细菌性疾病,再一次引起了人们的极大关注。但是,由于应用对象和环境的特殊要求以及噬菌体本身生物特性的展现,直接应用天然噬菌体存在一些不足,如宿主菌耐受性,产生变态反应等局限。因此,噬菌体裂解酶的“自外裂解”效应则成为扩大噬菌体生物制剂的应用范畴以及更好的提高其抗菌效应的科学基础。诸多研究表明噬菌体裂解酶具有能够破坏细菌胞壁质的功能,如Nelson等通过体外和在体实验证实噬菌体裂解酶能消除致病性链球菌的携带状态而不破坏正常菌群,而且噬菌体裂解酶不会损害固有的黏膜细胞,具有较高的安全性,目前此酶已开始Ⅰ期临床试验;Schuch等研究发现:重组的γ噬菌体裂解酶(PlyG)能引起炭疽敏感菌的裂解,并对感染炭疽的小鼠治愈率达到76.9%。 布鲁氏菌噬菌体有多种多价裂解型噬菌体株(如Tbilisi,Weybridge,Berkeley,Firenze等),可直接作用多种布鲁氏菌(含多种R型和S型)宿主细胞壁,效应的高亲和性与种属特异的细胞壁糖基部分有关,推断细菌难以产生对裂解酶的抗性。因此,将其作为治疗、洗消抗菌制剂具有明显的优势,使之有可能成为专门破坏细菌的“生物酶学消毒剂”。 基于此,本文首先对布鲁氏菌噬菌体国际参考株Tbilisi多价噬菌体进行生物性质和分子特征研究,并且针对噬菌体裂解酶进行基于生物信息学技术的结构分析和功能域预测,随后克隆了噬菌体裂解酶全长基因,并成功构建了噬菌体裂解酶重组质粒,随后经表达、纯化获得噬菌体裂解酶融合蛋白。最后,通过对噬菌体裂解酶的体外抑菌活性的鉴定和裂菌动力学分析来探讨其作为抗菌制剂的应用前景。其研究内容和结果主要包括以下几个方面: 1.布鲁氏菌噬菌体Tbilisi的生物性质及分子特征:通过透射电镜技术,噬斑观察,基因组随机扩增多态性分析,TA克隆技术对噬菌体Tbilisi的生物性质和分子特征进行全面分析,确定Tbilisi头部直径为57±2nm,短尾(32±3 nm长),分类学属于短尾噬菌体科。培养48小时后显示清晰噬斑,大小为2~3mm;基因组DNA分析为短尾病毒科dsDNA噬菌体,经限制性内切酶BamHI酶切产生2条清晰条带,表明分子量在34.5kb左右。SDS-PAGE全蛋白电泳显示Tb噬菌体含有9条主要结构蛋白,通过已完成的部分基因组分析工作,发现了包括噬菌体裂解功能相关蛋白与噬菌体尾领蛋白等。 2.布鲁氏菌噬菌体Tbilisi裂解作用关键酶的生物信息学分析:通过重点分析获得的类似于噬菌体裂解功能的蛋白,经过BLAST等初步确定为噬菌体裂解酶蛋白;通过跨膜域分析发现存在跨膜结构,推定可能直接对宿主细胞壁产生作用;并结合分子遗传与进化分析,神经网络预测二级结构,通过同源建模技术模拟分析蛋白质三维结构,采用Verify3D,拉氏构象图等方法评价三维结构的准确性,Procheck方法预测氨基酸残基89.2%在预测准确率最高区,9.2%在允许区,1.6%在一般区域(Val20,Aspl09,Asnl83,和Serl90),没有残基在错误区域,对噬菌体裂解酶蛋白遗传亲缘关系进行分析,为遗传操作提供目标,为设计新的蛋白质或改造已有蛋白质提供可靠的依据。LzA的最终模型采用了VERIFY 3D验证,其结果显示超过90%的氨基酸残基在准确的区域,即认为LzA同源建模模型的质量良好。Ramachandran图分析表明模型中所有氨基酸残基均分布在允许的范围内,模型中蛋白质主链残基的二面角构象合理;Procheck评价表明模型的结构和均方根z值大多在允许范围内,模型较为合理。同时,采用Protean模块,结合Kyte-Doolittle亲水性,Karplus-Schultz柔韧性,Jameson-Wolf抗原指数,Emini表面可能性方法预测,预测LzA的抗原指数,亲水性,柔韧性及表面可能性区域在肽段上分布比较均匀,并且有部分的重叠,分别为第15-20、81-88、141-150、182-193、251-262、271-280位氨基酸残基,推测这种重叠区域极有可能是LzA的B细胞抗原表位。为新的药物分子设计提供合理的靶分子及结构。 3.布鲁氏菌噬菌体Tbilisi裂解酶全长基因的克隆:通过对布鲁氏菌噬菌体Tbilisi裂解酶全长基因的扩增,将噬菌体裂解酶全长基因插入原核表达载体pET32a(+),成功构建了噬菌体裂解酶重组质粒pET32a(+)-LzA。该重组质粒经位于噬菌体裂解酶目的片段5′端的KpnⅠ和3′端XhoⅠ双酶切鉴定后,对重组质粒进行核苷酸测序,结果表明,重组质粒正确构建。 4.布鲁氏菌噬菌体Tbilisi裂解酶全长基因的表达与纯化:将噬菌体裂解酶重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),获得了表达稳定的噬菌体裂解酶基因工程菌。在制备融合蛋白包涵体的过程中,发现目的蛋白主要以分泌型表达为主,80%的融合蛋白存在于上清中。在上清中目的蛋白的表达量是包涵体表达量的4倍以上。故对融合蛋白上清行非变性的Ni~(2+)-NTA柱亲和层析以及目的蛋白的分子筛层析纯化后,能够获得单一条带的目的蛋白,基本无杂蛋白的存在,蛋白纯度在90%以上。说明采用非变性亲和层析可以实现噬菌体裂解酶融合蛋白的一步纯化。Bradford法测定目标蛋白浓度为10mg/ml。 5.噬菌体裂解酶融合蛋白裂菌动力学观察:用挖孔法测定噬菌体裂解酶对布鲁氏菌的抑菌活性。结果显示,在加入重组噬菌体Tb噬菌体裂解酶蛋白孔中,可形成了直径约为0.5~2cm的透明圆环,而阴性对照的孔中,无透明抑菌环的形成。初步证明噬菌体裂解酶基因蛋白对布鲁氏菌具有一定的裂菌活性。 6.噬菌体裂解酶融合蛋白环境稳定性研究:观察了在不同酸碱性环境下,不同温度和不同离子浓度的条件下的噬菌体裂解酶环境稳定性。裂解酶的最适pH值为7.0。-20℃冻存六个月的酶活力约为原来的57.8%;4℃储存六个月的酶活力约为原来的32.1%;25℃储存50天的酶活力约为原来的14.3%;37℃储存50天的酶活力约为原来的10.7%;50℃保存25min酶活力约为原来的7.9%;65℃保存10min的酶活力几乎全部丧失。100mmol/LEDTA对酶没有明显的抑制作用;0-20mmol/LNaCl、0-20mmol/LMgCl_2、0-10 mmol/LCaCl_2、0-10mmol/L ZnCl_2对其活性有激活作用;海藻糖作为酶的保护剂,0-200mmol/L海藻糖对酶没有明显的激活或抑制作用。由此认为噬菌体裂解酶环境稳定性较好,存在在外环境中使用的可能性。 综上所述,本研究通过对布鲁氏菌噬菌体Tbilisi的分子特征进行分析,认识其属于dsDNA短尾病毒科噬菌体,存在9条主要的结构蛋白,并且获得了尾领蛋白和噬菌体裂解酶蛋白等重要功能蛋白,结合生物信息学手段描述了布鲁氏菌噬菌体裂解酶的三维结构和功能预测,继而结合分子生物学技术,扩增到噬菌体裂解酶全长885bp的基因,为制备噬菌体裂解酶融合蛋白奠定了基础;同时,通过对噬菌体裂解酶的表达和纯化,拿到了具有活性的重组噬菌体裂解酶融合蛋白,融合蛋白主要以可溶性蛋白形式存在。获得的融合蛋白经体外活性检测证实,对布鲁氏菌具有一定的裂解活性并描述了裂菌动力学,随着噬菌体裂解酶的作用浓度增加,其抑菌效果越明显,可以形成0.5~2cm的透明抑菌圆环;环境稳定性评价观察到发挥抑菌效应的最适pH值、储存温度、离子浓度等,为进一步拓展其抗菌制剂的应用前景奠定一定的基础。


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