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蛋白酶激活受体-2在海水吸入大鼠急性肺损伤中的作用及机制研究

邓朝霞  
【摘要】: 背景与目的: 海水淹溺可引起海水吸入型急性肺损伤(SW-ALI),进一步发展可导致海水型急性呼吸窘迫综合征(SW-ARDS),病情凶险,死亡率高。由于炎症反应是ALI发病的关键环节,人们将对ALI的研究转向炎症调控机制的研究,以期控制炎症反应,减轻损伤,从而降低ALI的发病率和死亡率。蛋白酶激活受体-2(PAR2)属G蛋白偶联受体家族,激活后可参与炎症反应,但在肺部炎症反应中的致病作用还存在争议,在SW-AIL中的作用尚未提及,且PAR2激活后下游信号通路仍不清楚,有待进一步探讨。FUT-175作为一种丝氨酸蛋白酶抑制剂,可抑制PAR2的激活,减少炎症介质和细胞因子的释放,但其抗炎作用在ALI的研究中尚未提及,有待进一步研究。为此,本课题拟从细胞水平检测海水对A549细胞PAR2表达的影响,从分子水平探讨PAR2激活后的下游信号转导通路以及FUT-175和PAR2抗体对其下游信号通路的干预作用,从器官水平观察FUT-175对SW-ALI大鼠肺部炎症反应和肺微血管通透性的影响,旨在明确PAR2在SW-ALI中的作用及机制,从抗炎的角度揭示FUT-175对SW-ALI大鼠的保护作用,为临床应用FUT-175治疗SW-ALI提供更坚实的理论基础和实验依据。 方法: 1.将培养的A549细胞接种于6孔板中,随机分为对照组(control)、海水干预2、4、8、16h组,各组细胞干预相应的时间后进行指标观测。收集上清检测TNF-α和IL-8浓度,收集细胞用实时荧光定量PCR法和Western blot法检测PAR2 mRNA和蛋白表达水平。 2.将培养的A549细胞接种于6孔板中,随机分为对照组(control组)、海水干预组(seawater组)、海水+PAR2抗体组(PAR2-antibody组)、海水+FUT-175组(FUT-175组)、海水+SB203580组(SB203580组)、海水+PD98059组(PD98059组)、海水+SP600125组(SP600125组)。对照组加入无血清培养液,海水组加入海水培养8h;PAR2-antibody组用PAR2单克隆抗体2mg/L预处理1h后,加入海水继续培养8h;FUT-175组用FUT-175 10μM预处理1h后,加入海水继续培养8h;SB203580组用SB203580 10μM预处理1h后,加入海水继续培养8h;PD98059组用PD98059 10μM预处理1h后,加入海水继续培养8h;SP600125组用SP600125 0μM预处理1h后,加入海水继续培养8h。control组、seawater组、PAR2-antibody组和FUT-175组收集细胞用Western印迹法和EMSA法分别检测磷酸化p38MAPK蛋白表达量、磷酸化ERK蛋白表达量、磷酸化JNK蛋白表达量和NF-κB活化水平;各组细胞收集上清检测TNF-α和IL-8浓度。 3.采用海水吸入法复制大鼠ALI模型,吸入海水(4ml/kg)后成功建立ALI模型。将48只Wistar大鼠随机分为对照组、海水吸入2、4、8h组,取肺组织用实时荧光定量PCR法检测PAR2 mRNA表达水平,用Western blot法和免疫组化法检测PAR2蛋白表达情况。 4.采用海水吸入法和LPS吸入法复制大鼠ALI模型,96只Wistar大鼠随机分为对照组(control)、海水组(seawater组)、LPS组(LPS组)和FUT-175治疗海水吸入组(FUT-175组)。海水组和LPS组分别吸入海水(4ml/kg)和LPS(4mg/kg)建立ALI模型。seawater组:模型复制成功后20min,经尾静脉注射生理盐水2ml/kg。FUT-175组:海水型ALI模型复制成功后20min,经尾静脉注射FUT-175 10mg/kg。4组大鼠观察8小时,分别于模型建立及干预后0.5、1、2、4、8h进行动脉血气分析,最后检测肺微血管通透性(PMVP)、肺湿/干重比(W/D)、肺组织髓过氧化物酶(MPO)、血浆IL-8和TNF-α水平,并观察病理学变化。 结果: 1.与正常对照组比较,海水处理后,A549细胞PAR2 mRNA在4h时显著升高(P0.05),随着时间延长,在8h点达最高峰(为对照组的1.8倍),此后一直显著高于对照组(P0.01)。A549细胞PAR2蛋白表达量也在4h时显著升高(P0.05),在8h点达最高峰(为对照组的2.2倍),此后一直显著高于对照组(P0.01)。A549细胞经海水处理后,上清液中的IL-8和TNF-α迅速升高,2 h达最高峰,显著高于对照组(P0.01)。此后有所下降,但在所有时间点均显著高于对照组(P0.01)。 2.与正常对照组比较,海水处理后,A549细胞p38MAPK磷酸化水平、ERK磷酸化水平和JNK磷酸化水平显著升高(分别为对照组的3.1倍、1.8倍和3.2倍)(P0.01-0.05),NF-κB活化水平显著升高(为对照组的6.7倍)(P0.01),而FUT-175和PAR2抗体预处理组同海水处理组比较,A549细胞p38MAPK磷酸化水平、JNK磷酸化水平、ERK磷酸化水平和NF-κB活化水平显著降低(P0.01-0.05)。海水处理后,A549细胞培养上清液中IL-8和TNF-α显著升高(P0.01),而FUT-175、PAR2抗体、SB203580、PD98059和SP600125预处理组同海水处理组比较,上清液中IL-8和TNF-α则显著降低(P0.01)。 3.与正常对照组比较,海水吸入后,大鼠肺组织PAR2 mRNA和蛋白表达量在2h时即显著升高(P0.05),随着时间延长,在4h点达最高峰(为对照组的2.8倍),此后均显著高于对照组(P0.01)。同时大鼠肺组织PAR2蛋白表达量在2h时即显著升高(P0.05),随着时间延长,在4h点达最高峰(为对照组的4.2倍),此后均显著高于对照组(P0.01)。PAR2免疫组化显示,在正常对照组,PAR2微弱表达于肺泡、支气管上皮和肺泡巨噬细胞,海水吸入2h后,阳性反应明显增强,不仅见于肺泡和支气管上皮细胞,还见于肺微血管内皮细胞和气道平滑肌细胞。 4.与正常对照组比较,海水和LPS吸入致伤组大鼠PaO2下降、W/D比值增大、肺微血管通透性增高、肺组织MPO活性增高、血浆IL-8和TNF-α升高、肺组织病理形态学积分增加(P0.01);海水组PaO2明显低于LPS组,而MPO、W/D和PVMP明显高于LPS组(P0.01)。FUT-175治疗海水吸入组上述指标均显著改善(P0.01-0.05)。 结论: 1.海水处理A549细胞,可上调A549细胞PAR2的表达,导致IL-8和TNF-α释放的增加,同时可导致A549细胞结构的改变。 2.海水激活A549细胞PAR2后,通过MAPK信号通路和NF-B信号通路,导致IL-8和TNF-α释放增加,是海水处理A549细胞导致细胞损伤的可能机制。 3.丝氨酸蛋白酶抑制剂FUT-175和PAR2抗体可通过抑制PAR2的激活,对海水处理的A549具有保护作用。 4.海水吸入后大鼠肺组织PAR2表达上调,在海水所致急性肺损伤中起重要作用。 5.丝氨酸蛋白酶抑制剂FUT-175对海水吸入所致急性肺损伤大鼠具有保护作用,其机制可能是通过抑制肺组织PAR2的激活,阻断其下游的炎症反应,减轻肺损伤,降低肺血管通透性,减轻肺水肿。


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