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小鼠前额叶HCN通道在orexin A皮层兴奋性效应中的作用

李博  
【摘要】: Orexin(又称hypocretin)是1998年发现的一类小分子神经肽,主要由外侧下丘脑区特定神经元产生。Orexin系统包括来源于同一前体分子的两个单体orexin A和orexin B,以及两种特异的G蛋白耦联受体OX1R和OX2R。Orexin系统与机体一系列生理功能的调控相关,目前认为其最重要的功能是对睡眠-觉醒的调节。前额叶皮层(prefrontal cortex, PFC)是大脑高级神经功能活动的中枢,其功能的顺利执行与其觉醒状态的维持密切相关。“超极化激活-环核苷酸门控的阳离子通道(hyperpolarization- activated cyclic nucleotide-gated channel,HCN channel)”位于前额叶皮层锥体神经元的树突,其开放引发“超极化激活的电流(hyperpolarization-activated currents,Ih)”。HCN通道参与树突信息整合过程,因此在前额叶皮层兴奋性的调控中发挥着重要的作用。目前已知多种神经递质和化学药物可以通过其对HCN通道的调控来影响或者改变神经元的兴奋性。促醒肽orexin A对前额叶皮层锥体神经元具有较强的兴奋性效应,而HCN通道是否也参与了orexin A这种兴奋性效应的产生和维持,目前尚未有文献报道。 本实验采用全细胞膜片钳记录技术,在课题组前期实验的基础上,首先观察HCN通道对小鼠前额叶皮层缘前区(the prelimbic area, PL) V层锥体细胞兴奋性的影响,然后进一步研究orexin A对Ih电流的影响,分析HCN通道在orexin A细胞兴奋性效应中的作用,并对其相应的细胞信号机制作初步的探讨。结果如下: 1. HCN通道参与PL区V层锥体神经元兴奋性的调节 电流钳模式下,注入一定剂量的内向电流,使记录细胞产生一定频率的自发性放电,给予HCN通道阻断剂ZD7288灌流给药后,记录细胞的放电频率明显加快;相反,给予8-Br-cAMP使Ih增大后,记录细胞的放电频率明显减慢。另外,在静息电位水平下,ZD7288使固定电流强度刺激下的动作电位发放数目显著增多;相反,给予8-Br-cAMP使动作电位发放数目显著减少。上述结果表明:HCN通道状态能够影响前额叶皮层神经元的兴奋性,即增强HCN通道活性可以降低神经元兴奋性,反之,抑制HCN通道活性则可以增加神经元兴奋性。 2. Orexin A的兴奋性效应与反应细胞Ih电流的产生具有密切关系 实验中,并非所有的PL区V层锥体神经元对orexin A均有反应,反应率为51.9%(28/54),根据细胞能否产生Ih电流,对反应阳性细胞作进一步的分类,结果发现:Ih (+)锥体神经元对orexin A的反应率为66.7%(24/36),远远高于Ih (-)锥体神经元对orexin A的反应率22.2%(4/18)(P0.01),此结果强烈提示orexinA与Ih电流具有密切关系。 3. Orexin A对HCN通道具有抑制作用,该效应由OX1R介导,PKC参与 电流钳模式下,orexin A使反转电位“sag”明显减小,其中,“sag ratio”值由1.31±0.07下降到1.02±0.05(P0.05, n=7)。电压钳模式下,orexin A使Ih电流幅值在各个跃阶电压水平均有减小,-120mv下最明显。另外,通过获得Ih电流激活曲线的“tail”电流图像,根据Boltzmann方程计算出每一电压水平下的Itail.max-Itail /Itail. max值,结果发现:orexin A使Ih电流激活曲线向超极化方向移动。上述结果表明:orexin A对HCN通道具有抑制作用。 电压钳模式下,重复前面的实验方式,给予OX1R阻断剂SB-334867,结果显示:给药前,orexin A使-120mv下的Ih电流下降到51.6±6.7pA;给药后,Ih电流恢复到75.4±8.2pA(P0.05, n=3),将SB- 334867和orexin A冲洗置换后,Ih电流基本恢复到最大水平;给予PKC抑制剂BIS- II,结果显示:给药前,orexin A使Ih电流下降到原有幅值的52.6±4.8%,给药60min和90min后,Ih电流分别恢复到65.4±5.5% (P0.05, n=7)和83.6±6.7%(P0.01, n=5)。上述结果表明:OX1R和PKC参与介导orexin A对HCN通道的抑制作用。 4.HCN通道的状态影响orexin A的细胞兴奋性效应 电流钳模式下,先选择对orexin A具有明确兴奋性反应且具有典型Ih电流的PL区V层锥体神经元,然后给予8-Br-cAMP增强Ih电流,再次观察orexin A对记录细胞的兴奋性效应。结果显示:给药后,orexin A的兴奋性效应有所减弱,动作电位发放频率由5.83±0.45Hz下降到3.78±0.66Hz(P0.05, n=4)。此结果表明HCN通道的状态能够影响orexin A的细胞兴奋性效应。 综上所述,本研究结果表明:第一,HCN通道参与PL区V层锥体神经元兴奋性的调节。第二,orexin A对HCN通道具有抑制作用,并且该效应由OX1R介导,PKC参与。第三,orexin A的兴奋性效应与反应细胞Ih电流的产生具有密切关系, HCN通道状态能够影响orexin A的细胞兴奋性效应。


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