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rhBMP-2和Delta-1对人牙髓干细胞分化影响的实验研究

于娜  
【摘要】: 牙髓干细胞是存在于牙髓组织中具有干细胞性质的未分化间充质细胞,具有多向分化潜能,可形成功能性成牙本质细胞和牙本质。 Notch受体、配体在牙齿发育早期有表达,在正常牙髓组织中Notch受体不表达,而当成年牙髓损伤后早期其配体Delta-1表达上调,揭示Notch信号参与了牙髓损伤修复过程,并且Delta-1在牙髓干细胞分化中也起重要作用。BMPs属于TGF-β超家族成员,有多种BMPs参与了牙齿的发育。其中BMP-2主要存在于未分化的造牙本质细胞中,并且参与了牙齿形态的早期形成,并在成牙本质细胞的分化形成中起重要的调控作用,其基因的转录在早期的牙胚上皮和后来的成牙本质细胞中都有发现。另外,研究表明BMP-2参与体内牙髓组织损伤修复过程,且在体外可通过调节细胞的增殖状态,促进牙髓细胞ALP合成等作用,诱导牙髓细胞向成牙本质细胞分化。Notch通路和BMPs信号同为调控细胞增殖、分化的关键信号,其作用存在交叉点。 rhBMP-2对牙髓干细胞自身Delta表达以及二者共同作用对牙髓干细胞分化有何影响?目前有关这一问题的研究报道较少。本课题在对人牙髓干细胞体外分离、培养和鉴定的基础上,进一步研究分析rhBMP-2和Delta与人牙髓干细胞分化的关系,为探讨影响人牙髓干细胞分化的因素提供参考依据。 目的 研究rhBMP-2对DPSCs分化及Delta表达的影响,并进一步研究rhBMP-2和Delta-1共同作用对牙髓干细胞分化的影响。 方法 1.细胞培养与鉴定:牙髓干细胞来源于临床上因正畸或阻生而拔除的健康牙齿,采用酶消化法分离获得并常规原代及传代培养;观察细胞生长状态、形态及其变化;细胞克隆形成率;免疫荧光、免疫组化及RT-PCR法检测细胞表型。 2.细胞分化的检测:为检测rhBMP-2对牙髓干细胞ALP活性的影响,取第5代牙髓干细胞,按以下分组:空白对照组,25,50,100ng/ml rhBMP-2组,分别在培养的第7,14,21天采用ALP活性测定试剂盒进行检测。rhBMP-2作用于牙髓干细胞后RT-PCR检测DSPP表达的情况;Western blot方法检测连续培养第7、14、21天Delta表达情况。为检测rhBMP-2和Delta-1联合应用对人牙髓干细胞分化的影响,用含Delta-1质粒转染COS7细胞,从而在培养液中获得含Deltal-Fc融合蛋白。取第5代牙髓干细胞,按以下分组:空白对照组,rhBMP-2、Delta-1以及二者联合作用组,在连续作用的第7、14、21d检测细胞碱性磷酸酶活性。 结果: 1.连续培养的人牙髓干细胞增殖快,细胞呈集落状生长,克隆形成率为4-35个/10~4细胞,采用免疫组化染色及RT-PCR方法显示细胞表达vimentin、GFAP、nestin、osteocalcin、Ⅲ型胶原,免疫荧光法显示细胞表达STRO-1。 2.rhBMP-2作用组ALP活性明显高于空白对照组(P<0.01),并检测出本实验所用rhBMP-2最佳作用浓度为50ng/ml,RT-PCR检测rhBMP-2作用后细胞有DSPP表达。Western-blot检测在细胞生长第21天rhBMP-2刺激组Delta表达高于对照组(P<0.05)。 3.rhBMP-2和Delta-1联合作用组ALP活性明显高于对照组及二者单独作用组(P<0.01)。 结论: 1.rhBMP-2可明显增强牙髓干细胞的ALP活性,促进人牙髓干细胞向成牙本质细胞分化。 2.rhBMP-2可促进人牙髓干细胞Notch配体Delta的表达。 3.rhBMP-2和Delta-1之间存在相互协同作用,可明显增强人牙髓干细胞ALP活性。


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