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超声辐照载诺帝脂质微泡抗兔VX2肿瘤血管生成的实验研究

黄泽君  
【摘要】: 背景: 肿瘤血管生成在大多数实体瘤的生长和转移中有着重要的作用,它已成为抗肿瘤治疗的一个重要靶点。肿瘤血管生成是多步骤、多因素参与的复杂病理过程。选择肿瘤血管生成中的一些关键环节或参与的重要因子作为靶点,研制应用特异性肿瘤血管生成抑制药物,以靶向调控肿瘤血管生成,控制肿瘤的生长和转移,达到治疗肿瘤的目的。随着肿瘤细胞的异质性增加,肿瘤间质中新生血管的形状、结构、密度和在肿瘤组织内的三维分布特征(即肿瘤微血管构筑表型,tumor microvascular architecture phenotype,T-MAP)呈现其特有的异质性。这种异质性不仅影响肿瘤侵袭性和预后,也是抗血管生成疗效存在明显差异的重要原因之一。改变肿瘤微血管构筑表型异质性,促使肿瘤微血管构筑表型正常化,从而改变肿瘤微环境,能从整体上提高恶性实体肿瘤的治疗效果,这成为了近年来抗肿瘤血管治疗的重大转变。随着对超声微泡技术的深入研究,人们已发现超声微泡造影剂不仅可以增强超声显像,还可以作为一种新型的药物载体,能靶向给药,提高治疗部位的药物浓度,减少药物用量,降低不良反应,提高药物的安全性和有效性,目前已经成为抗肿瘤治疗领域研究的热点。我科已成功制备了携载新型抗肿瘤药物诺帝(Nordy)脂质微泡,本研究拟研究肿瘤组织与正常组织微血管构筑表型的特征并进一步探讨超声靶向破坏载药微泡是否是一种简便、安全、高效、且有一定靶向性的新型诺帝体内递送系统,为抗血管生成治疗提供一种新的治疗方法。 研究目的: 1.了解兔VX2肌肉肿瘤与正常肌肉组织微血管构筑表型的特征; 2.观察超声辐照载诺帝脂质微泡抗兔VX2肿瘤血管生成的影响; 3.观察兔VX2肿瘤应用超声造影对比脉冲序列CPS(contrast pulse sequence)成像技术和ACQ (AxiusTM auto tracking contrast quantification)定量分析软件得到的造影定量新生血管血流灌注参数与肿瘤组织周细胞变化的关系,为抗肿瘤血管生成治疗的疗效观察和预后估测提供实验依据。 方法: 1.采用隧道组织块包埋法建立VX2肌肉肿瘤模型。观察兔VX2肌肉肿瘤与正常肌肉组织微血管构筑表型特征:(1)HE染色和免疫组化包括微血管密度(MVD)和周细胞阳性细胞数(PN)的测定,观察肿瘤组织及正常肌肉组织的病理改变和微血管内皮细胞及周细胞的表达情况;(2)透射电镜观察正常肌肉组织和肿瘤组织中的微血管的超微结构;(3)采用解剖学技术微血管铸型方法显示正常肌肉和肿瘤组织微血管的三维分布特征。 2.30只VX2肌肉肿瘤模型兔随机分为6组,每组5只,即:对照组(A组)、单纯静脉注射诺帝组(B组)、单纯静脉注射载诺帝脂质微泡组(C组)、单纯超声辐照组(D组)、超声辐照+静脉注射空白脂质微泡组(E组)、超声辐照+静脉注射载诺帝脂质微泡组(F组)。二维超声动态监测肿瘤大小和生长情况,比较各组的肿瘤生长率和肿瘤生长抑制率,免疫组化染色测定微血管密度(MVD)观察各组对肿瘤微血管生成的表达情况。 3.10只VX2肌肉肿瘤模型兔,应用超声造影对比脉冲序列成像技术(CPS)及ACQ定量分析软件测定肿瘤血管血流灌注各参数值和峰值强度比率(RPI),并与肿瘤组织标记周细胞的免疫组化染色测定的微血管密度(MVD)和周细胞阳性细胞数(PN)对照,进行相关性分析。 结果: 1.采用隧道组织块包埋法成功地建立VX2肌肉肿瘤模型兔,成功率为100%。 2.兔VX2肌肉肿瘤与正常肌肉组织免疫组化结果:CD34抗体染色切片中肿瘤组织内可见棕染的内皮细胞分布不均匀,多数聚集在肿瘤边缘处,而正常肌肉组织内皮细胞分布均匀。肿瘤组织的MVD为(18.10±6.10),正常肌肉组织的MVD为(8.60±2.55),肿瘤组织的MVD明显多于正常肌肉组织中的表达(P0.01)。α-SMA抗体染色切片中肿瘤组织及正常肌肉组织微血管周细胞胞质内均出现棕黄色颗粒,肿瘤组织边缘的阳性周细胞呈簇状、管状和条索状结构。肿瘤组织的PN为(27.20±8.01),正常肌肉组织PN为(14.10±3.84),肿瘤组织中的PN明显多于正常肌肉组织中的表达(P0.01)。 3.正常肌肉组织和肿瘤组织电镜观察结果:正常肌肉组织内的微血管结构正常:内径分布较均匀,基底膜厚度均匀、完整,内皮细胞及周细胞与基底膜附着紧密。而肿瘤组织内的微血管结构明显异常:微血管内径分布不均匀,大多数管腔扩张囊变,基底膜变薄,不均匀,内皮细胞与基底膜附着松散,部分分离。 4.微血管铸型直观的显示了正常肌肉组织和肿瘤组织微血管的三维分布特征。正常肌肉组织的微血管较稀疏,呈树枝状,走行自然,分布较均匀;而肿瘤组织的微血管密集、走行紊乱,大多数走行迂曲呈蛇形,分布不均匀,囊状扩张的血管与迂曲狭窄甚至闭塞的血管并存,构成复杂吻合的血管网、血管团。 5.超声辐照+静脉注射载诺帝脂质微泡组肿瘤生长速度明显减慢,其肿瘤生长率与其他各组间差异有显著统计学意义(P0.05);超声辐照+静脉注射载Nordy脂质微泡组的微血管密度显著低于其他各组,差异有显著统计学意义(P0.05)。 6.肿瘤组织与周围肌肉组织超声造影血流灌注参数定量分析结果:肿瘤组织的PI为(15.29±4.14) dB、RPI为(2.95±1.26) dB/s,明显高于周围肌肉组织〔PI为(11.19±3.52)dB、RPI为(2.16±1.26)dB/s〕,它们的差异有显著统计学意义(P0.05);但肿瘤组织与周围肌肉组织的AT、TTP差异无统计学意义(P 0.05)。 7.肿瘤组织造影血流灌注参数PI为(15.29±4.14)dB,RPI为(2.95±1.26)dB/s;肿瘤组织标记周细胞的MVD为(17.75±7.60),PN为(26.10±10.59);肿瘤组织造影血流灌注参数PI与MVD和PN显著正相关(r值分别为0.866、0.857,P0.01),RPI与MVD和PN显著正相关(r值分别为0.647、0.648, P0.01)。 结论: 1.通过免疫组化内皮细胞和周细胞的表达、透射电镜观察和微血管铸型显示了肿瘤组织和正常肌肉组织的微血管构筑表型的特征,为观察抗肿瘤血管生成治疗新策略——肿瘤微血管构筑表型正常化提供了新的手段。 2.超声辐照载诺帝脂质微泡对兔VX2肿瘤有明显的抗血管生成的作用,成为了一种简便、安全、高效、且有一定靶向性的新型诺帝体内递送系统,为抗肿瘤血管生成治疗提供一种新的途径。 3.超声造影血流灌注参数PI和RPI反映了肿瘤血管生成中周细胞的变化,为观察抗肿瘤血管生成治疗中周细胞的变化提供一定的实验依据。


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