异常甲基化调控结直肠癌细胞Irinotecan代谢酶相关基因的表达及其意义

【摘要】： 伊立替康(lrinotecan,CPT-11)是近年来重要的结直肠癌治疗药物。其作用机理是通过转化为7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)干扰和稳定拓扑异构酶I与DNA双链形成的易解离复合物,抑制DNA的复制而发挥其细胞毒性。CPT-11代谢主要经羧酸酯酶(CES)水解转化为活性代谢物SN-38,再由尿苷二磷酸葡萄糖苷转移酶1A (UGT1A)葡萄糖醛基化灭活为非活性结合型SN-38G,β-葡萄糖醛酸苷酶(GUSB)可以逆向将SN-38G脱去葡萄糖醛基转化为SN-38。近来研究表明,伊立替康在肿瘤部位的活化比在肝脏的活化更有意义[1, 2],因此,调控结直肠癌细胞内CPT-11代谢酶的表达直接关系到SN38浓度而影响化疗药物的疗效。 研究发现很多化疗药物代谢酶存在自身表遗传学基因沉默,而甲基化是抑制这些酶的基因表达的重要机制[3]。CPT-11代谢酶相关基因表达是否存在甲基化调控机制、目的基因去甲基化是否能提高化疗疗效是本课题的研究方向,拟揭示结直肠癌化疗药物耐受可能的表遗传学机制,为逆转肿瘤耐药和化疗增敏提供新的思路和对策。目的:观察异常甲基化在调控结直肠癌细胞中CPT-11代谢酶相关基因CES2、UGT1A1及GUSB基因表达中的作用,并观察目的基因去甲基化对结直肠癌细胞CPT-11化疗药物敏感性的影响。 方法:采用临床结直肠病理组织标本及结直肠癌细胞株(LoVo、HT-29、LS174T、DLD-1、HCT-116、RQO、HCT-15、和SW-480)为研究对象。分三部分进行: 第一部分探讨结肠癌组织中CES2、UGT1A1及GUSB蛋白表达与各项临床病理参数的相关性,以及甲基化与相应基因表达之间的关系:采用免疫组织化学染色检测结直肠癌患者99例、相应癌旁样本23例及大肠腺瘤8例中CES2、UGT1A1、GUSB蛋白表达;采用甲基化特异性PCR(MSP)法检测结直肠癌及癌旁组织中CES2、UGT1A1及GUSB基因的甲基化状态。应用SPSS13.0软件进行统计分析,若P0.05,则认为有显著的统计学差异。 第二部分检测体外培养的八种结直肠癌细胞株中的CES2、UGT1A1及GUSB基因启动子甲基化状态及相应蛋白表达情况:LoVo、HT-29、LS174T、DLD-1、HCT-116、RKO、HCT-15及SW-480。(1)采用MSP检测不同结直肠癌细胞株中的CES2、UGT1A1及GUSB基因启动子甲基化状态;(2)每种细胞株分两组。实验组:加DAC(终浓度为5μM),每24小时更换培养液;对照组:加等量PBS,每24小时重复换液一次。72小时细胞生长至铺满80～90%后收取细胞。采用荧光定量PCR检测上述两组每种结直肠癌细胞株中CES2、UGT1A1及GUSB mRNA表达,采用westernblot方法检测CES2、UGT1A1及GUSB蛋白表达。 第三部分探讨疗效与甲基化及去甲基化的相关性研究:(1)采用MTT法,检测各型结肠癌细胞株经或未经DAC处理后对伊利替康的敏感性的变化,计算IC50并分析其与CES2、UGT1A1及GUSB mRNA表达的相关性;(2)制备UGT1A1siRNA,利用siRNA基因转染试验盒,在流式细胞仪下观察细胞转染率,采用台酚蓝法测定细胞毒性鉴定,RT-PCR筛选UGT1A1 SiRNA有效干扰序列,采用MTT检测UGT1A1 SiRNA转染HT-29细胞后CPT-11细胞毒性的变化;(3)选用异常甲基化的RKO细胞,经或不经去甲基化处理恢复UGT1A1表达后,采用化学合成的UGT1A1 SiRNA转染,通过MTT检测CPT-11细胞毒性IC50的变化。 结果 第一部分:CES2的表达:癌旁组织(13/23, 56.5%),大肠腺瘤(4/8, 50.0%),结直肠癌(35/99, 35.3%);UGT1A1的表达:癌旁组织(8/23, 34.7%),大肠腺瘤(2/8,25%),结直肠癌(19/99, 19.2%);GUSB的表达:癌旁组织(11/23, 47.8%),大肠腺瘤(4/8,50.0%),结直肠癌(38/99, 38.3%)。CES2、UGT1A1在结直肠癌组织表达弱于癌旁组织(P0.05)。CES2表达对于不同临床分期之间有显著性差异(P0.05)。结直肠癌组织与癌旁组织中CES2和GUSB基因启动子基本呈一致性的未甲基化或半甲基化状态。结直肠癌组织中UGT1A1基因86.4%(51/59)甲基化阳性;癌旁组织中65.2%(15/23)甲基化阳性。UGT1A1甲基化与UGT1A1表达呈负相关(P0.05)。 第二部分:(1)CES2、UGT1A1及GUSB甲基化和未甲基化的阳性对照扩增带清晰。CES2基因启动子呈未甲基化状态,UGT1A1基因启动子甲基化阳性为LS174T、DLD-1、HCT-116、RKO、HCT-15,甲基化阴性为LoVo、HT-29、SW-480。GUSB基因启动子呈半甲基化状态。(2)CES2、UGT1A1及GUSBmRNA及蛋白表达在LoVo、HT-29、LS174T、HCT-116、RKO、SW480结直肠癌细胞株存在显著差异,使用5-脱氧杂氮胞苷(DAC)处理后,CES2及GUSB在其低表达的细胞株无明显增加,UGT1A1在LoVo、HT-29、SW480呈高表达,LS174T、HCT-116、RKO、HCT-15及DLD-1低表达。使用5-脱氧杂氮胞苷(DAC)处理后低表达的LS174T、HCT-116、RKO、HCT-15及DLD-1均有明显增加,其中UGT1A1 mRNA在HCT-116及RKO细胞株表达分别增加17倍和26倍。 第三部分:不同结直肠癌细胞株对CPT-11敏感性存在差异(P0.05),其中LoVo细胞对CPT-11敏感性最低,RKO细胞对CPT-11的敏感性最高。两者IC50值相差近5倍。结直肠细胞株内CES2及GUSB表达与IC50呈负相关性(r=-0.58651, P0.01,r=-0.62527,P0.01),提示CES2或GUSB表达量越高,对CPT-11越敏感;细胞内UGT1A1表达与IC50无明显相关性,但剔除SW480细胞后,其r=0.790648,P0.05,仍提示UGT1A1表达越高对CPT-11耐药可能性越大;筛选出siRNA有效干扰序列,干扰效率达78%,合适的siRNA转染浓度为50nM;转染HT-29细胞后IC50下降近一倍(P0.01);UGT1A1基因甲基化的RKO细胞去甲基化处理后IC50反而增高,但UGT1A1siRNA转染后,去甲基化处理组较未经去甲基化处理组IC50下降。 结论 结直肠病理组织存在CES2、UGT1A1及GUSB表达存在差异性,其在结直肠癌组织中的表达均弱于相应的瘤旁组织及腺瘤,CES2表达与肿瘤分期存在关联。 结直肠癌细胞UGT1A1基因启动子存在甲基化,是UGT1A1基因表达沉默的重要机制。而CES2呈低甲基化,GUSB呈半甲基化,均不参与调控相应基因的表达。 CPT-11细胞毒性与UGT1A1表达呈负相关,与CES2及GUSB呈正相关。UGT1A1基因siRNA可显著增加CPT-11对结直肠癌细胞的化疗敏感性。 UGT1A1甲基化是影响CPT-11化疗敏感性的重要因素,去甲基化治疗可能会降低CPT-11的化疗敏感性。