人脐血源基质细胞对MHC半相合造血干细胞移植小鼠GVHD调节作用的研究

【摘要】： 异基因造血干细胞移植(Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation,Allo-HSCT)是目前治疗恶性血液病的有效方法。HLA(Human Leucocyte Antigen)相合的亲缘相关或无关供者是Allo-HSCT最合适的供者。然而仅有25%～30%的患者能找到HLA相合的亲缘供者;在无亲缘关系人群中找到HLA相合供者的概率是1/5万~1/10万,甚至更低。90%以上的患者能够找到HLA半相合的亲属(父母、子女、兄弟姐妹或堂表亲)供者,若能顺利跨越HLA限制,可为更多需接受移植治疗而无相合供者的患者获得治愈的机会。然而HLA半相合移植患者发生移植物抗宿主病(Graft Versus Host Disease,GVHD)的几率大约为80%左右(1),GVHD是Allo-HSCT的主要并发症之一,是导致移植失败的重要原因。寻求安全有效的防治Allo-HSCT后GVHD的新措施成为临床关注的焦点。骨髓来源多能间充质基质细胞(multipotent mesenchymal stromal cells, MSC)主要生物学功能包括支持造血细胞的增殖、分化和成熟,同时也具有对免疫细胞的调节作用。大量动物模型和临床研究证实MSC对GVHD有一定的防治作用。但由于骨髓收集方法相对困难、MSC的多向分化潜能等均限制了其在临床的应用。本室采用CD34+细胞分选,结合Dexter培养分离出脐带血中另外一群非造血细胞:人脐血源基质细胞(hUCB-derived stromal cells,hUCBDSC),且已经证实其具备体外支持造血的能力(3)。推测hUCBDSC可能具有和MSC相似的对免疫细胞调节作用的特性。本研究在构建MHC(Major Histocompability Complex)半相合移植小鼠GVHD模型基础上,着眼于启动GVHD异源反应的两个重要因素T细胞和DC细胞,从体外和体内探讨hUCBDSC的免疫调节作用以及可能机制。 一、主要方法 (一)体外实验 1.采用6%明胶和1.077 g/L percoll分离液分离脐带血中的单个核细胞,磁珠分选CD34+细胞,含12.5%HS、12.5%FBS、10-6mol/L氢化可的松、10ng/mlSCF、10ng/ml bFGF的DMEM培养液培养hUCBDSC,37℃、5%CO2、饱和湿度恒温箱孵育。48h后全量换液,以后每周半量换液;待细胞融合度达到80%左右时,进行传代培养; 2.采用流式细胞仪检测原代分离培养和冻存复苏后hUCBDSC细胞表面免疫分子HLA-Ⅰ、Ⅱ类分子,CD80,CD86,CD40和CD40L的表达率; 3.采用70%percoll分离液和RD systems公司的Mouse T cell Enrichment Columns进行小鼠脾脏T细胞的分选; 4.分离小鼠骨髓单个核细胞后,rmGM-CSF和LPS诱导BM-DC的分化和成熟; 5.将PHA或DC刺激的小鼠脾脏T细胞和不同浓度的hUCBDSC共培养, CCK-8检测细胞增殖情况; 6.PHA刺激条件下小鼠T细胞和hUCBDSC共培养后,流式细胞仪检测T细胞的周期、凋亡、CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(CD4+Treg)以及Th1/Th2亚群的变化。 7.小鼠BM-DC和hUCBDSC共培养后,扫描电镜和透射电镜观察BM-DC形态和结构,流式细胞仪检测表面免疫分子MHC-Ⅱ、CD80、CD86的表达,CCK-8检测试剂盒检测其刺激异源T细胞增殖反应的能力。 (二)体内实验 1.受鼠C57BL/6×BALB/c F1接受750 cGy 60Coγ射线照射后4小时内经尾静脉注射供鼠C57BL/6来源的骨髓细胞BMC(1×107/只)、脾脏细胞SP(1×107/只),建立MHC半相合造血干细胞移植小鼠急性GVHD模型; 2.受鼠移植BMC和SP的同时或1w后输注hUCBDSC(1×107/只),观察小鼠生存时间、GVHD临床表现和靶器官组织病理变化; 3.细胞移植后1w、2w、3w和4w,流式细胞仪检测受鼠脾脏T细胞CD4+Treg、Th1/Th2亚群的比例和DC表面免疫分子MHC-II、CD80和CD86的表达。 二、主要结果 (一)体外实验 1.hUCBDSC组成性高表达HLA-Ⅰ(84.1±2.9%),几乎不表达HLA-Ⅱ(1.6±0.3%)类分子,共刺激分子CD80(0.8±0.1%),CD86(0.8±0.1%),CD40(0.6±0.1%)和CD40L(0.5±0.1%)。细胞冻存复苏不影响上述分子的表达; 2.hUCBDSC并不会引起小鼠T细胞的增殖,相反,以剂量依赖性方式抑制PHA或DC刺激的小鼠T细胞增殖; 3.在PHA刺激72h后,处于G1期的T细胞占62.1±3.7%,S期占35.6±2.7%。而当与hUCBDSC共培养时, 84.3±3.6%T细胞处于G1期,12.3±1.5%T细胞处于S期。两者比较有显著统计学意义(p0.01); 4.PHA刺激单独培养的T细胞和与hUCBDSC共培养的T细胞中早期凋亡细胞的比例无明显差别(p0.05); 5.和单独培养的T细胞比较,与hUCBDSC共培养的T细胞中CD4+Treg亚群所占的比例显著增高(1.2±0.3% vs 12.1±1.4%,p0.01); 6.在PHA刺激时,T细胞单独培养或与hUCBDSC共培养5天后, Th1/Th2的比例分别为1.4±0.1%和0.7±0.1%,两者之间比较具有显著统计学意义(p0.01); 7.当BM-DC和hUCBDSC共培养时,电镜观察其表面突起显著减少,细胞器也不丰富。表面免疫分子MHC-II、CD80和CD86的表达显著降低,且其刺激异源T细胞增殖的能力也显著降低。 (二)体内实验 1.受鼠C57BL/6×BALB/c F1接受750 cGy TBI后输注供鼠C57BL/6来源的BMC和SP后,通过对生存期、临床表现和组织病理的观察,证实成功构建了MHC半相合HSCT小鼠GVHD模型; 2.细胞移植后4h内或1w后输注hUCBDSC,小鼠长期生存率从20%分别提高到60%和40%,显著降低了小鼠GVHD临床评分和组织病理评分; 3.细胞移植后各时相点流式细胞仪分析受鼠脾脏T细胞亚群和DC的变化,输注hUCBDSC的受鼠脾脏CD4+Treg比例增高、Th1/Th2亚群比值降低、DC表面免疫分子MHC-II、CD80和CD86的表达降低。 三、结论 1.hUCBDSC体外具有低免疫源性的特点,可以抑制PHA或DC刺激的小鼠T淋巴细胞的增殖。可能的作用机制包括阻止T细胞从G1期进入S期,诱导CD4+Treg的产生,降低Th1/Th2亚群的比例和对BM-DC成熟的影响。 2.hUCBDSC可以延长MHC半相合造血干细胞移植后小鼠的生存期,减轻GVHD临床表现和靶器官组织病理变化,这可能与体内CD4+Treg的增多、Th1/Th2极化,以及不成熟DC的产生有关。