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基于Bcl-2抗Fas凋亡特性的HepaRG细胞—鼠嵌合肝动物模型的建立

蒋黎  
【摘要】: 肝脏是最早进行细胞移植实验的器官之一。人肝细胞移植不仅可作为治疗肝衰竭和多种代谢性疾病的有效手段,而且将人肝细胞移植到动物体内,形成"嵌合肝",甚至在动物体内重建人类肝组织,以期获得可感染肝炎病毒的实验动物模型,成为当前研究的一个重要方向。 要想建立理想的人鼠嵌合肝动物模型,使人肝细胞在小鼠体内长时间存活并保持功能,就必须满足外源肝细胞移植到动物体内定植的基本条件:一是对外源肝细胞无免疫排斥;二是宿主肝细胞形成再生需求和环境;三是移植肝细胞较宿主肝细胞更具增殖优势。 为了寻找不仅能使小鼠肝损伤,形成再生需求和环境,同时又赋予移植细胞更强生长优势的方法。我们设想,利用Fas抗体诱导小鼠肝细胞进入可控的凋亡状态,移植转Bcl-2基因的人肝细胞具有的抗凋亡能力使其在鼠肝内具有更强的增殖优势,来促进人肝细胞在嵌合鼠体内增殖。 Fas是一种细胞表面信号分子,属于肿瘤坏死因子受体超家族成员。当与Fas配体或特异性抗体(如Jo2 mAb)结合后,Fas启动细胞凋亡。Bcl-2是一种细胞浆蛋白,它属于常生长蛋白质家族(ever-growing family of protein)中的一员。该家族在细胞凋亡中起着主导作用。研究证明,小鼠肝细胞对Jo2 mAb所诱导的细胞凋亡非常敏感,给小鼠反复注射小剂量的Jo2 mAb不会引起肝外组织器官明显损伤,却可造成肝细胞大面积的凋亡,引起动物出现暴发性肝衰竭症状和死亡。而表达Bcl-2的转基因肝细胞可完全阻止由Jo2mAb引起的肝细胞凋亡。 HepaRG细胞是从慢性丙型肝炎感染的肝癌患者体内非瘤组织分离而得的细胞株,在广义上属于永生化细胞株的范畴。HepaRG细胞与正常的肝细胞相比,具有相似的形态学和生理学功能;作为潜能祖细胞,具有向肝细胞和胆管上皮细胞双向分化的潜能。细胞培养显示,HepaRG细胞在分化过程中,能持续表达药物代谢酶(I项药代酶P450和Ⅱ项药代酶)达6w之久;体内移植表明,HepaRG细胞对裸鼠未显示明显的致瘤性,在Alb-uPA/SCID小鼠体内,保持了分化功能,并具有成熟肝细胞的生物学特性,说明HepaRG可作为药物代谢研究和细胞移植的良好的体内外模型。 本研究将基于Bcl-2抗凋亡特性,以转染了Bcl-2基因的HepaRG细胞为移植细胞,联合Fas抗体诱导SCID小鼠肝细胞凋亡来构建人鼠嵌合肝动物模型。因为Jo2 mAb可诱导小鼠肝细胞的凋亡,给外源性肝细胞生长让出“空间”,提供了肝再生需求及环境,为移植的外源性肝细胞提供了增殖信号。同时,表达Bcl-2转基因的移植肝细胞能抵御Jo2 mAb引起的肝细胞凋亡,使移植肝细胞具有较鼠肝细胞更强的生长和生存优势。此外,选择SCID小鼠作为移植受体可避免免疫排斥反应的发生,所以该策略很好地满足了异种细胞移植的基本条件。 方法和结果 1.Jo2 mAb对体外小鼠肝细胞和HepaRG细胞培养的影响 体外培养小鼠肝细胞和HepaRG细胞,加入不同浓度的Jo2 mAb(终浓度为10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL),以了解Jo2 mAb作为诱导小鼠肝细胞凋亡的手段,对移植的HepaRG细胞是否也有相同影响。 加入Jo2 mAb 5μg/mL于72h、10μg/mL于48h和72h对小鼠肝细胞有致凋亡征象,表现为细胞体积缩小、胞质浓缩、胞核固定,细胞折光率明显增加;瑞氏染色出现凋亡小体;MTT测定该三时相点细胞抑制率分别为52%、51%和67%,与空白对照组有显著性差异﹙P0.05﹚;小鼠肝细胞DNA出现明显排列成梯状的分子条带,而ALT、AST以及LDH无明显变化。对照HepaRG细胞不同浓度的Jo2 mAb作用未发现明显的凋亡征象。 2.经Jo2 mAb体内诱导小鼠肝细胞凋亡后的HepaRG细胞移植研究 采用Jo2 mAb腹腔注射,剂量为0.3mg/kg,诱导20只SCID小鼠制备急性肝损伤模型,24h内按照实验动物随机分组方法,挑选小鼠经脾移植2×106个HepaRG细胞为实验组(10只),未经HepaRG细胞移植为对照组(10只)。 实验组小鼠有9只存活超过4w,而对照组小鼠3d内先后死亡9只,实验组血清ALT和AST趋于正常,显著低于对照组(P 0.01),且存活时间显著高于对照组(P 0.01)。实验组经HepaRG细胞移植后肝组织结构完整,无明显出血、坏死,而对照组肝组织结构模糊,出血和大面积点、片状坏死明显。实验组移植后4w免疫组化可见人白蛋白、CK18、人Hep Par 1阳性表达细胞,肝组织免疫荧光可见人白蛋白阳性细胞的表达,但表达数量较少。 3.可稳定转染Bcl-2的HepaRG细胞株的建立 虽然Jo2 mAb对HepaRG细胞体外无致凋亡作用,但鉴于移植到小鼠体内的HepaRG细胞尽管能存活,但不具有增殖优势,经Jo2 mAb启动细胞凋亡途径,缺乏抗凋亡能力。为此,我们将pSFFV-neo Bcl-2质粒转染HepaRG细胞,经过G418和抗Fas抗体筛选,获得双抗性克隆,从而建立稳定表达Bcl-2蛋白的HepaRG细胞株。 稳定转染Bcl-2蛋白的HepaRG细胞株,培养14d形态学无变化。免疫组化检测到Bcl-2以及人白蛋白的表达,采用RT-PCR法检测到Bcl-2的mRNA以及Western blot法检测到Bcl-2表达的蛋白,而对照未转染Bcl-2的HepaRG细胞以及转染空载质粒的HepaRG细胞均未见Bcl-2的阳性表达。 4.Bcl-2/HepaRG细胞-鼠嵌合肝动物模型的构建 将2×106个Bcl-2转基因HepaRG细胞经脾移植到SCID小鼠体内,移植后1d始给予Jo2 mAb 0.2mg/Kg腹腔注射,1次/周,持续10周建立Bcl-2/HepaRG细胞-鼠嵌合模型(n=43);移植HepaRG细胞,同样给予Jo2 mAb注射建立HepaRG细胞-鼠嵌合模型(n=25);移植HepaRG细胞,未腹腔注射Jo2 mAb的小鼠为对照组(n=14)。 三组小鼠均能存活至24w。Bcl-2/HepaRG细胞-鼠嵌合肝模型肝组织免疫组化和免疫荧光可见Bcl-2蛋白的表达,且随着移植时间的延长,从2w开始增加,16w表达最强,此后逐渐衰减,至24w降到最低。 三组小鼠肝组织免疫组化都能检测到人白蛋白和CK18的表达,免疫荧光还可检测到Ki67的表达。Bcl-2/HepaRG细胞-鼠嵌合肝人白蛋白、CK18以及Ki67阳性持续时间为2~24w,整体趋势为随着移植后时间推移,呈先升高后逐渐下降的过程,在移植后16w出现峰值,人肝细胞在嵌合鼠肝组织中的替代率约为22%;而HepaRG细胞-鼠嵌合肝上述三指标阳性表达时间为2~20w,高峰时间为12w,替代率约为15%;对照组的表达时间就仅为2~12w,高峰时间8w,替代率仅为8%左右。此外,Bcl-2/HepaRG细胞-鼠嵌合肝4~24w、HepaRG细胞-鼠嵌合肝4~20w和对照组4~12w肝组织可通过RT-PCR检测到人白蛋白mRNA的阳性条带、Western Blot于血清中可检测到人白蛋白,同时经ELISA可定量检测到血清中人白蛋白的含量。Bcl-2/HepaRG细胞-鼠嵌合肝模型人血清白蛋白高峰值为0.101μg/mL,出现在16w;而HepaRG细胞-鼠嵌合肝模型人血清白蛋白高峰值为0.042μg/mL,出现在12w;对照组人血清白蛋白高峰值为0.022μg/mL,出现在8w。 结论: 1.证实Jo2 mAb可体外诱导小鼠肝细胞凋亡。发现Jo2 mAb对HepaRG细胞体外无明显致凋亡作用。 2.证实Jo2 mAb体内可致小鼠急性肝损伤,HepaRG细胞移植能保护小鼠避免发生Jo2 mAb所致急性肝损伤,显著改善小鼠的存活率。经HepaRG细胞移植后发现,其虽能在SCID小鼠体内少量存活,但无移植细胞的增殖优势,在Jo2 mAb启动细胞凋亡途径后,可能不具备抗击凋亡的能力,生长、增殖空间有限。 3.建立Bcl-2基因稳定转染的HepaRG细胞株。发现转Bcl-2的HepaRG细胞在形态学、生物学功能上与HepaRG细胞无异,能在细胞、分子以及蛋白水平表达Bcl-2蛋白。 4.采用转Bcl-2的HepaRG细胞移植,联合Jo2 mAb腹腔注射诱导肝细胞凋亡的方法,建立的嵌合鼠肝组织能表达Bcl-2蛋白。HepaRG细胞不仅能在小鼠体内存活,而且保持人肝细胞的特性,产生人白蛋白,维持近24w,成功建立HepaRG细胞-鼠嵌合肝动物模型。在所建立的HepaRG细胞-鼠嵌合肝动物模型中,发现HepaRG细胞转Bcl-2基因的表达,使其在小鼠体内替代率增高,存活时间延长,数量增多,人白蛋白的表达含量增加。


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