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HGF/c-Met对左向右分流继发肺动脉高压大鼠肺血管重构的影响

林毅  
【摘要】:研究背景和目的 左向右分流型先天性心脏病使肺循环长期处于高灌注状态,肺动脉管壁承受血流冲击的机械应力持续过度增加,致使内皮细胞(endothelial cell, EC)受损、平滑肌细胞(smooth muscle cell,SMC)增生、肺血管管腔狭窄,肺血管发生重构(pulmonary vascular remodeling, PVR),形成肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension , PAH)。PAH程度直接影响患者的治疗及预后,进入肺动脉高压晚期,治疗困难,预后不良。对于左向右分流型先天性心脏病PAH形成过程、机制、干预和预防的研究仍是值得研究的重要课题。 近年来在缺血性心肌病方面的研究发现肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)具有较强的促血管内皮细胞增生,修复血管内皮作用。它通过促进血管内皮细胞分化、增生,保护血管内皮,具有抑制内皮细胞凋亡的作用,并可抑制纤维化反应。研究表明外源性HGF可促进兔心肌梗死后缺血部位的血管内皮细胞增生,修复受损的血管内膜防止血栓形成,并可促进形成新的微血管。原癌基因编码蛋白Met (mesenchymal-epithelial transition factor, c-Met)是至今唯一被认识的HGF高亲合力受体。目前,对损伤细胞修复和血管形成的作用和机制等方面的研究备受关注。 HGF/c-Met在左向右分流肺动脉高压的肺组织的表达情况以及HGF/c-Met对此类肺动脉高压的肺血管重构有何影响仍不得而知,该问题值得研究。本课题建立左向右分流型PAH大鼠模型,并给予外源性的HGF,通过运用生理记录仪和病理学方法分别观察血流动力学和肺血管结构的变化,运用免疫组织化学、Western blotting等方法分析HGF、c-Met在左向右分流型PAH大鼠肺组织的表达,运用免疫组织化学方法检测半胱氨酸的天门冬氨酸蛋白酶-3(cysteine-aspartic proteases-3,Caspase-3)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)在大鼠肺组织的表达,以及运用TUNEL法检测肺动脉平滑肌细胞的凋亡情况,从而研究HGF/c-Met对左向右分流型PAH大鼠肺动脉SMC的增殖与凋亡的调节作用以及对左向右分流型PAH的PVR的影响。本课题将为探讨左向右分流型PAH形成的机制及HGF/c-Met对左向右分流型PAH的PVR的影响提供实验依据及理论指导。 方法 本研究分为两部分 第一部分:HGF/c-Met在左向右分流继发肺动脉高压大鼠肺血管中的表达及作用。 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,随机均分为对照组(Control Group),分流组(Shunt Group)和HGF组(HGF Group),分流组及HGF组行套管法颈总动脉-颈外静脉分流术以建立左向右分流继发肺动脉高压大鼠模型,对照组行假手术,HGF组于术后第3天开始予腹腔注射HGF蛋白2mg/kg/日。分流组和HGF组分别于术后第4、8、12、16周行超声检查明确分流血管的通畅性,检测肺动脉压力、右心室肥大指数等;常规HE染色观察肺小动脉重构的病理变化,计算机图像分析系统测量肺动脉管壁厚度占外径的百分比(MT%);免疫组织化学和Western blotting检测HGF、c-Met蛋白在肺动脉的表达。 第二部分:HGF/c-Met对左向右分流继发肺动脉高压大鼠肺血管平滑肌细胞凋亡和增殖的影响及意义 免疫组织化学检测Caspase-3、PCNA蛋白在肺中等动脉的表达,Western blotting检测Caspase-3蛋白在肺组织的表达,脱氧核糖核苷酸末端转移酶缺口末端标记(TUNEL)法检测肺中等动脉SMC凋亡情况,计算机图像分析系统测量肺中等动脉中层凋亡细胞数占SMC数的百分比(apoptotic index, AI),及增殖细胞数占SMC数的百分比(proliferation index, PI)。 结果 第一部分: 1.实验大鼠均存活,分流组和HGF组合计术后4周通畅率为100%,术后8周为95%,术后12周为80%,术后16周为75%;总通畅率为87.5%。 2.分流组肺动脉收缩压(pulmonary arterial systolic pressure, PASP)、平均肺动脉压(mean pulmonary arterial pressure, mPAP)在术后4周即显著高于对照组(p0.01),术后8周略有降低,术后12周及16周逐渐增高并达高峰,均显著高于对照组(p0.01);HGF组PASP、mPAP术后各时间点均显著高于对照组(p0.01),且增高程度一致,但均低于分流组,术后12周及16周显著低于分流组(p0.01);各组主动脉收缩压(aortic systolic pressure, ASP)和平均主动脉压(mean aortic pressure, mAP)均无明显变化,组间无明显差异(p0.05)。 3.分流组术后8周右心室肥大指数(right ventricular hypertrophy index, RVHI)较对照组显著升高(p0.01),此后增高趋势更加明显;HGF组无明显升高趋势,与对照组相比无明显差异(p0.05)。 4.HE染色见分流组术后4周肺中等动脉开始出现EC轻度增生,胞核增大,胞体由扁平状转变为高柱状,SMC以增生为主,伴有肥大,MT%显著高于对照组(p0.01),并逐渐增高,于术后16周达高峰;HGF组肺动脉管壁EC增生明显,胞核增大,胞体呈高柱状,SMC未见明显增生,各时间点MT%与对照组相比无明显差异(p0.05),与分流组相比术后4周明显低于分流组(p0.01),此后差异更加显著(p0.01)。 5.免疫组化染色显示:HGF、c-Met蛋白在三组大鼠肺中等动脉EC及SMC均有表达,两种细胞的表达变化基本一致,Image-Pro Plus 5.1图像分析软件测量累积光密度(IOD)半定量分析显示,分流组HGF及c-Met蛋白在术后8周达高峰,显著高于对照组(p0.01),术后12周表达量降低,但仍显著高于对照组(p0.01),术后16周恢复至对照组水平,与对照组相比无明显差异(p0.05);HGF组HGF及c-Met蛋白在各时间点表达均明显高于对照组和分流组(p0.01),于术后8周达高峰,此后稍下降,但仍显著高于分流组(p0.01)。 6.Western boltting检测大鼠肺组织HGF蛋白(80Kd)、c-Met蛋白(142Kd)表达变化趋势相似。对照组各时间点均出现弱阳性条带,分流组较对照组有所增强,术后8周及12周较明显,HGF组各时间点均可见强阳性条带。计算机图像分析系统测量灰度值半定量分析(以HGF/β-actin、c-Met/β-actin表示)显示,分流组HGF/β-actin术后4周显著高于对照组(p0.01),术后8周达高峰著高于对照组(p0.01),术后12周及16周恢复至对照组水平,与对照组相比无明显差异(p0.05);HGF组HGF/β-actin术后4周即显著增高,此后逐渐升高,于术后16周达高峰,各时间点均显著高于对照组和分流组(p0.01);分流组c-Met/β-actin术后4周显著高于对照组(p0.01),术后8周达高峰显著高于对照组(p0.01),术后12周稍下降,但仍显著高于对照组(p0.01),术后16周恢复至对照组水平,与对照组相比无明显差异(p0.05);HGF组c-Met/β-actin术后4周即显著增高,此后逐渐升高,各时间点均显著高于对照组和分流组(p0.01)。 7.Pearson相关性分析:HGF与c-Met蛋白在大鼠肺中等动脉的表达呈正相关(r =0.962,p 0.01);而HGF、c-Met蛋白在大鼠肺中等动脉的表达与MT%呈负相关(r =-0.328,p0.05;r =-0.402,p=0.01),与PASP呈负相关(r =-0.568,p0.05;r =-0.607,p =0.01),与mPAP呈负相关(r =-0.593,p =0.01;r =-0.634,p 0.01)。MT%与PASP和mPAP均呈正相关(r =0.767,p 0.01;r =0.789,p 0.01)。 第二部分: 1.免疫组化染色显示:Caspase-3蛋白在三组大鼠肺中等动脉EC及SMC均有表达, Image-Pro Plus 5.1图像分析软件测量累积光密度(IOD)半定量分析显示,分流组Caspase-3蛋白表达在术后4周达高峰,显著高于对照组(p0.01),术后8周有所降低,但仍显著高于对照组(p0.01),此后继续降低,术后12周及16周显著低于对照组(p0.01);HGF组Caspase-3蛋白表达各时间点均显著低于对照组(p0.01),呈逐渐降低趋势,术后16周降至最低。 2.Western boltting检测大鼠肺组织Caspase-3蛋白(35Kd)表达:对照组各时间点均出现弱阳性条带;分流组术后4周即出现强阳性条带,术后8周强度有所减弱,术后12周及16周为弱阳性条带;HGF组术后4周可见阳性条带,其余各时间点均为弱阳性条带。计算机图像分析系统测量灰度值半定量分析(以Caspase-3/β-actin表示)显示,分流组术后4周即达高峰,显著高于对照组(p0.01),在术后8周稍下降,仍显著高于对照组(p0.01),术后12周及16周显著低于对照组(p0.01);HGF组术后4周达高峰,显著高于对照组(p0.01),但显著低于分流组(p0.01),此后逐渐降低,术后12周及16周显著低于对照组(p0.01)。 3.TUNEL检测显示:三组大鼠肺中等动脉EC及SMC均可见TUNEL阳性细胞,计算机图像分析系统测量肺中等动脉SMC的AI显示,分流组AI术后4周达高峰,显著高于对照组(p0.01),此后逐渐下降,术后8周、12周仍显著高于对照组(p0.01),术后16周降至对照组水平,与对照组相比无明显差异(p0.05);HGF组AI明显降低,各时间点均显著低于分流组(p0.01),术后8周、12周及16周均显著低于对照组(p0.01)。 4.免疫组化染色显示:PCNA蛋白在三组大鼠肺中等动脉EC及SMC均有表达,计算机图像分析系统测量肺中等动脉中层增殖细胞数占SMC数的百分比(proliferation index, PI)。分流组增殖细胞明显增多,各时间点PI均显著高于对照组和HGF组(p0.01),术后16周有所下降,但仍显著高于对照组和HGF组(p0.01);HGF组术后4周增高明显,显著高于对照组(p0.01),之后逐渐降低,术后8周、12周与对照组相比无明显差异(p0.05),术后16周显著低于对照组(p0.01)。 5.分析大鼠肺中等动脉平滑肌细胞PI/AI:分流组各时间点PI/AI均显著高于对照组和HGF组(p0.01),并逐渐升高;HGF组术后4周显著高于对照组(p0.01),之后逐渐降低,术后12周与对照组相比无明显差异(p0.05),术后16周显著低于对照组(p0.01)。 6.Pearson相关性分析:Caspase-3蛋白在大鼠肺中等动脉的表达与大鼠肺中等动脉MT%呈负相关(r =-0.890,p0.01),与大鼠肺中等动脉平滑肌细胞PI/AI呈负相关(r =-0.630,p0.01);大鼠肺中等动脉平滑肌细胞PI/AI与MT%呈正相关(r =0.536,p0.05)。 结论 1.套管法颈总动脉-颈外静脉分流术可造成大鼠类似左向右分流型先天性心脏病,可导致肺动脉压力持续升高,肺中等动脉管壁中层增厚,右心室肥厚等,藉此成功建立左向右分流继发肺动脉高压大鼠模型; 2.左向右分流继发肺动脉高压大鼠肺组织中HGF、c-Met蛋白的表达与肺动脉压力及肺中等动脉管壁厚度百分比呈负相关;外源性HGF可有效提高HGF、c-Met蛋白在模型大鼠肺组织的表达,降低其肺动脉压力; 3.左向右分流继发肺动脉高压大鼠肺中等动脉SMC增殖与凋亡失衡,促使肺动脉管壁增厚,导致肺血管重构,外源性HGF可调节SMC增生与凋亡平衡,抑制其过度增生,缓解肺血管重构。


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