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急性低压缺氧视网膜神经节细胞损伤及牛磺酸防护效应研究

陈卡  
【摘要】: 低压缺氧(hypobaric hypoxia,HBH)是海拔大于3000m地区如高山、高原、高空等的重要环境因素。视网膜是对缺氧高度敏感的神经组织,未经习服者进入低压缺氧环境则会出现暗适应时间延长、视力下降、色觉减退等视功能障碍,严重者出现眼底病改变甚至失明。以往研究认为急性低压缺氧视网膜功能障碍主要是视网膜内动静脉失代偿性扩张、视乳头水肿、眼底出血等所致,而对视网膜神经元形态结构功能变化的报道甚少。视网膜主要由光感受器-双极细胞-神经节细胞三级神经元组成,研究发现,急性低压缺氧早期反映视网膜内层神经元功能的振荡电位(oscillatory potentials,OPs)异常,以及模拟高原缺氧大鼠视网膜内层结构疏松、变厚等现象,提示急性低压缺氧视网膜内层神经元结构功能损害。神经节细胞(Retina ganglion cells,RGCs)位于视网膜内层,是视觉信息传递的重要中继神经元,其通过树突和胞体上的突触收集来自双极细胞的视觉信号,经过整合后以动作电位沿轴突即视神经快速传递至视觉中枢,RGCs损伤势必导致视觉功能障碍,因此,深入认识急性低压缺氧暴露时RGCs结构与功能变化及其病理机制,并寻找合适的防护剂具有重要意义。 针对神经元缺氧损伤可能的病理机制,国内外已进行大量研究,主要认为:①线粒体功能障碍是神经元缺氧损伤的中心环节。缺氧条件下,一方面,线粒体氧化磷酸化解耦联,细胞能量ATP供应不足,可干扰神经元细胞膜上Na~+、K~+离子通道以及受体特性,影响神经元电生理功能实现;另一方面,线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)异常开放,促进线粒体膜通透性转换(mitochondrial permeability transition,MPT)发生,在加重线粒体损伤同时,释放促凋亡因子如细胞色素C(cytochrome C,cyt C)、凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF),启动细胞凋亡。②钙依赖性蛋白酶(Calpains)与神经元缺氧损伤密切相关。Calpain是一类由Ca~(2+)激活、非溶酶体来源的半胱氨酸蛋白酶。缺氧时,胞内Ca~(2+)浓度升高激活Calpains,其可水解大量突触功能相关蛋白如突触蛋白(Synapsin,SYS)、细胞骨架蛋白如α-spectrin和MAP-2、微管相关蛋白tau等,直接破坏神经元结构及功能;还参与Caspase-12活化促进Caspase-3激活,以及水解Bcl-xL的LooP结构域,促进细胞凋亡。 牛磺酸(Taurine)是体内一种游离的小分子氨基酸,在可兴奋性组织如大脑、视网膜、心肌等含量非常丰富。自1975年Hayes发现喂饲牛磺酸缺乏饲料将导致幼猫失明开始,牛磺酸在视网膜的生理功能就备受关注,其不仅是视网膜早期分化的决定因子,还通过形成Tauret调节视黄醇代谢以及作为抑制性神经递质参与视觉形成。近年研究还发现,牛磺酸可有效保护多种应激状态(缺血、缺氧、高压、高糖等)下心肌细胞、皮质颗粒细胞、海马神经元以及视网膜细胞,主要与其抗氧化、调节渗透压、调节胞内钙稳态等特性有关。本实验室以往研究发现,2.4%牛磺酸营养干预能有效防止急性低压缺氧暴露视网膜牛磺酸含量降低,有效保护视网膜胶质细胞Müller细胞,但牛磺酸能否改善视网膜功能以及保护RGCs尚需进一步证实。 本课题体内研究以SD大鼠为实验对象,牛磺酸营养干预14d后,采用低压氧舱构建模拟海拔5000m高度的急性低氧动物模型;体外实验以视网膜神经节转化细胞RGC-5细胞为研究对象,牛磺酸预处理4h后,运用三气培养箱制备RGC-5细胞低氧(5% O2)损伤模型。利用多焦视网膜电图(multi-focal electroretinogram,mfERG)、中脑靶核团逆行示踪技术、组织及超微组织病理学、免疫荧光化学法、流式细胞术、实时定量PCR(real time-PCR)、Western blotting等多种实验技术方法,观察急性低氧视网膜RGCs结构功能改变及牛磺酸对RGCs的防护效应,并探讨其防护分子机制。 主要结果和结论如下: 1.急性低压缺氧暴露24h,低氧组及牛磺酸干预组mfERG的最大混合反应及振荡电位(OPs)的a波、b波、OP2峰时延长、幅值降低,其中低氧组a波、b波、OP2幅值较正常对照组分别降低58.6%、56.5%、48.3%,而牛磺酸干预组a波、b波、OP2幅值显著高于低氧组(p0.05),较正常对照组分别降低22.9%、34.1%、35%。急性低氧处理后7d,恢复期低氧组最大混合反应b波、OP2幅值仅达正常对照组的77.7%、81.3%(p0.05),而牛磺酸干预组与正常对照组无显著性差异。以上结果说明,急性低压缺氧导致视网膜功能减退及RGCs电生理反应性下降,牛磺酸干预能有效防止急性低氧诱导的视功能减退。 2.急性低氧导致低氧组大鼠视网膜组织结构疏松,内网状层(IPL)及节细胞层(GCL)肿胀变厚,IPL内可见Fluoro-Jade C(FJC)标记的变性神经元突起,超微结构显示低氧组IPL轴突内线粒体肿胀、空化,树突终末微管溶解,突触稀少,突触小泡少;牛磺酸干预组视网膜内层厚度较低氧组薄,FJC阳性染色弱于低氧组,IPL树突轴突也见肿胀,但突触复合体结构清晰,突触小泡较多、排列整齐。以上结果提示,急性低氧导致视网膜IPL、GCL内突触及神经元突起等结构破坏,牛磺酸干预对急性低氧条件下视网膜形态结构具有一定的保护效应。 3.采用荧光金(FG)逆行示踪技术标记全视网膜RGCs发现,急性低氧24h后,低氧组与牛磺酸干预组大鼠视网膜内均可见少量胞浆中FG分布不均匀的RGCs以及吞噬了FG的分枝型小胶质细胞,提示RGCs损伤。TUNEL染色结果显示,低氧组及牛磺酸干预组内核层(INL)、GCL内可见散在的TUNEL阳性细胞,牛磺酸干预组RGCs凋亡指数显著低于低氧组(1.3±0.2 % vs. 2.4±0.5 %;p0.05)。体外实验发现,随低氧时间延长,RGC-5细胞逐渐皱缩、变圆及脱落,细胞活力下降,LDH释放率升高,细胞凋亡率上升,低氧24h、48h细胞凋亡率分别为(17.75±3.95)%和(47.59±6.70)%;牛磺酸预处理(0.01mM、0.1mM、1mM)可有效提高细胞存活率,其中0.1mM牛磺酸浓度最为有效,低氧48h牛磺酸预处理组细胞凋亡率仅为(17.14±5.14)%。以上结果提示,急性低压缺氧导致RGCs变性凋亡,而牛磺酸干预能有效减少急性低氧诱导的RGCs丢失。 4.体内试验发现,正常视网膜内Calpain-2呈低表达、低活性状态;急性低氧24h后,低氧组视网膜全层尤其是IPL和RGCs内高表达Calpain-2、酶活性增强,而牛磺酸干预组Calpain-2表达量及酶活性均低于低氧组(p0.05)。突触蛋白、α-Spectrin、tau是Calpain-2酶解特异底物,急性低氧暴露后各组视网膜上述蛋白表达均降低,而牛磺酸干预组高于低氧组(p0.05)。体外研究也发现,牛磺酸预处理组可降低低氧条件RGC-5细胞内Calpain-2 mRNA转录表达及酶活性,以及减少α-Spectrin、tau降解。以上结果提示,牛磺酸可通过降低急性低氧诱导的Calpain-2表达及活化,进而抑制Calpain-2介导的神经元结构及功能相关蛋白降解,有效保护视网膜及RGCs功能和形态结构。 5.体外研究发现,随低氧时间延长RGC-5细胞[Ca~(2+)]_i逐渐升高、谷胱甘肽(GSH)含量逐渐减少,低氧处理24h后RGC-5细胞大量MPTP开放,反映线粒体膜电位(Δψm)的JC-1红/绿荧光比值下降,ATP含量显著下降,胞浆内cyt C及Caspase-3活性亚基(17kDa)含量显著上升,可见AIF核转位;牛磺酸预处理能有效拮抗低氧诱导的[Ca~(2+)]_i上升和GSH耗竭,与低氧组相比,低氧处理24h后RGC-5细胞MPTP开放程度低,JC-1红/绿荧光比值高,ATP含量高于低氧组(7.89±1.25 vs. 4.64±1.03 nmol/mg prot; p0.05),胞浆内cyt C、Caspase-3活性亚基(17kDa)以及核内AIF含量高于低氧组。体外研究也发现,急性低压缺氧24h后,低氧组与牛磺酸干预组视网膜Caspase-3活性亚基(17 kDa)以及SBDP 120kDa含量增加,但牛磺酸干预组显著低于低氧组(p0.05)。以上结果提示,牛磺酸可通过维持胞内钙稳态、抗氧化,调节线粒体膜通透性转换孔开放,进而防止MPT引发的线粒体功能障碍,下调线粒体Cyt C/Caspase-3以及不依赖于Caspase的AIF凋亡信号转导,对视网膜神经元及RGCs发挥保护效应。 综上所述,急性低压缺氧导致RGCs神经元电生理反应性下降,神经元突触及突起等结构破坏以及RGCs细胞变性丢失;牛磺酸干预能有效减轻急性低氧诱导的RGCs形态及功能的损伤,主要与抑制Calpain-2介导的神经元结构及功能相关蛋白降解,以及调控MPTP开放进而防止MPT引发的线粒体功能障碍和下调线粒体凋亡信号转导等有关。


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