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骨髓基质细胞HIF-1α异常表达在急性白血病骨髓血管生成中的作用及人参皂甙Rg3干预机制的研究

王金良  
【摘要】: 目的: 骨髓微环境中新生血管形成在急性白血病的发生和进展中起重要作用,但其机制尚未完全阐明。骨髓微环境和白血病细胞都可通过分泌促血管生成因子或介质促进血管生成,两者具有同等重要的地位。研究发现,骨髓血管生成不仅发生在急性髓细胞白血病而且发生在急性淋巴细胞白血病。肿瘤新生血管形成是一个非常复杂的病理生理过程,其中,癌基因和抑癌基因的表达异常、局部缺氧的组织反应、细胞因子等均发挥了重要的作用。缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)作为重要的转录调控因子,可调控多种促血管生成基因及因子的表达,有可能参与到急性白血病的血管生成中。 以往的研究发现,在多种恶性实体肿瘤的发生发展过程中,HIF-1α的表达均有明显的异常,并与肿瘤的新生血管形成和预后相关;而HIF-1α表达增高则与抑癌基因的失活和组织缺氧等相关。在急性白血病的骨髓基质细胞中也存在HIF-1α的高表达,但与白血病骨髓微环境中新生血管之间的关系尚无直接的研究证据。本实验旨在以往研究的基础上,研究HIF-1α及其调控的下游血管生成相关因子VEGF在急性白血病骨髓基质细胞中的表达特点及规律,分析HIF-1α与急性白血病骨髓微血管密度之间的关系;探讨HIF-1α相关信号转导途径参与急性白血病骨髓血管形成的机制;并进一步研究抗血管生成药物Rg3对急性白血病血管骨髓生成的抑制作用及其相关信号途径,为HIF-1α在白血病骨髓造血微环境异常中的作用提供可靠的实验依据。 方法: 1.急性白血病骨髓基质细胞HIF-1α异常表达与骨髓血管生成的关系研究 收集15例急性髓细胞白血病患者、10例急性淋巴细胞白血病患者和10例正常对照骨髓活检标本及骨髓基质细胞: (1)应用免疫组化SP法检测骨髓活检标本中HIF-1α、VEGF的表达,并计数微血管密度值(MVD); (2)分离和培养急性白血病患者及正常骨髓基质细胞; (3)Western blot法检测HIF-1α、VEGF在急性白血病骨髓基质细胞中的表达。 2.人参皂苷Rg3抗急性白血病骨髓血管生成的作用及其相关机制的研究 收集初发白血病患者骨髓标本31例,分为急淋组和急非淋组。正常骨髓标本28例作为对照组: (1)分离和培养急性白血病患者及正常骨髓基质细胞; (2)药物分组:人参皂甙Rg3作用骨髓基质细胞的浓度分别为20、40、60、80、100mg/L,培养6、12、24、48h; (3)MTT法检测人参皂苷Rg3对骨髓基质细胞的最佳作用时间和作用浓度; (4)RT-PCR检测人参皂苷Rg3处理前后急性白血病骨髓基质细胞HIF-1α及VEGF mRNA表达的变化; (5)Western blot法、免疫荧光法检测人参皂苷Rg3处理前后急性白血病骨髓基质细胞HIF-1α、VEGF、p-Akt、p-ERK蛋白表达的变化。 结果 1.急性白血病骨髓基质细胞HIF-1α异常表达与骨髓血管生成的关系研究 (1)急性髓细胞白血病(AML)组及急性淋巴细胞白血病(ALL)组HIF-1α表达明显高于正常对照组(P0.05),急性髓细胞白血病组与急性淋巴细胞白血病组差异无统计学意义(P0.05);(2)急性髓细胞白血病(AML)组及急性淋巴细胞白血病(ALL)组VEG表达也明显高于正常对照组(P0.05),急性髓细胞白血病组与急性淋巴细胞白血病组差异无统计学意义(P0.05);(3)急性髓细胞白血病组及急性淋巴细胞白血病组MVD高于正常对照组(P0.05),急性髓细胞白血病组与急性淋巴细胞白血病组差异无统计学意义(P0.05);(4)骨髓活检标本中,急性白血病组HIF-1α与VEGF表达、MVD呈正相关(r=0.848,P0.05;r=0.211, P0.05),VEGF表达与MVD计数呈正相关(r=0.249,P0.05);(5)骨髓基质细胞中,急性白血病组HIF-1α与VEGF表达、MVD计数呈正相关(r=0.683,P0.05;r=0.374,P0.05),VEGF表达与MVD计数呈正相关(r=0.491,P0.05)。 2.人参皂苷Rg3抗急性白血病骨髓血管生成的作用及其相关机制的研究 (1)MTT法检测人参皂苷Rg3对骨髓基质细胞的最佳作用时间为24h,最佳作用浓度为40ug/mL;(2)经人参皂苷Rg340ug/mL作用24 h后,急性白血病骨髓基质细胞HIF-1α、VEGF mRNA表达及蛋白表达均减少,与对照组相比有显著差异(P0.05);(3)人参皂甙Rg3能够抑制信号通路关键蛋白Akt、ERK1/2蛋白的磷酸化,从而分别阻断PI3K/Akt、MAPK途径,与对照组相比有显著差异(P0.05)。 结论 1.急性白血病骨髓微血管密度明显高于正常对照组,提示血管生成可能在急性白血病发生和发展中发挥重要作用。 2.HIF-1α在急性白血病中骨髓活检标本及骨髓基质细胞中高表达,HIF-1α的高表达可能通过上调VEGF表达促进急性白血病血管生成,骨髓基质细胞HIF-1α的高表达可能在急性白血病的发生和发展中起重要作用。 3.人参皂苷Rg3通过HIF-1α抑制VEGF mRNA及蛋白表达;而MAPK、PI3K/Akt两条途径在调控抑制HIF-1α蛋白表达中均有重要作用;人参皂苷Rg3可能在抑制急性白血病血管生成中发挥重要作用。


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