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外源性PTH1-34可缓解FGFR3功能增强型点突变所致软骨发育障碍及骨折愈合延迟

谢杨丽  
【摘要】: FGFR3的十多种功能增强型(Gain-of-function)点突变可引起多种人类软骨发育障碍性侏儒,包括软骨发育不全(Achondroplasia, ACH)、季肋发育不全(Hypochondroplasia, HCH)、致死性骨发育不全(Thanatophoric Dysplasia, TD)等。95%以上的软骨发育不全由FGFR3的功能增强型点突变引起。软骨发育不全是一种常染色体显性遗传病,是人类侏儒最常见的类型。软骨发育不全主要影响经软骨内成骨(Endochondral Ossification)过程形成的四肢骨等长骨(Long Bone)。这些患者除可通过外科手术进行部分延长肢体外,目前尚无有效的治疗方法。 Chen等利用基因敲入技术建立了模拟人ACH的FGFR3G369C点突变小鼠模型,个体明显短小,头颅短圆,长骨生长板组织形态结构异常,软骨细胞增殖、分化能力减弱;Deng等发现,FGFR3基因敲除小鼠(FGFR3-/-)有长骨过度生长、生长板增殖软骨细胞带和肥大软骨细胞带变宽、软骨细胞增殖活性增加。这些结果提示FGFR3是软骨发育的负性调节分子,影响软骨细胞的增殖活性和分化。 Chen等发现,FGFR3信号通过STATs和Ihh抑制软骨细胞增殖,FGFR3信号可能与PTHrP/IHH信号相互独立抑制软骨细胞分化。Yamanaka等发现表达FGFR3ACH(FGFR3 G380R)和TDII(FGFR3 K650E)突变的ATDC5细胞凋亡增加,给予PTHrP处理后可缓解。Ueda等发现,PTH1-34抑制软骨细胞分化和凋亡,增加骨长度,可以一定程度上缓解FGFR3突变对长骨生长迟缓带来的影响。PTH1-34可能一定程度上缓解FGFR3功能增强对细胞与组织带来的生长受损。那么PTH1-34是否能在动物水平上缓解FGFR3功能增强所引起的软骨发育不全,有待于进一步研究。 FGFR3除影响骨骼发育外,还参与骨折修复的调节。本实验室Su等发现FGFR3在骨折愈合过程中通过抑制软骨形成、分化以及矿化软骨基质降解导致骨折愈合延迟。如何缓解FGFR3激活引起的骨骼发育异常及骨折修复延迟有重要的临床意义。 重组人PTH1-34氨基酸片段的多肽类激素药物特立帕肽(teriparatide)是得到美国食品与药物管理局(FDA)批准的用于临床治疗绝经后妇女的骨质疏松的药物,其机制与其促进成骨有关。此外,一些工作观察了其对骨折愈合的影响。Alkhiary和Nakazawa研究发现PTH1-34可能通过增加软骨形成来刺激软骨内成骨。PTH1-34是否可缓解ACH小鼠由于软骨形成分化障碍所引起的骨折愈合延迟还有待于研究。 据此,本课题利用野生型和FGFR3G369C/+(ACH)小鼠,间断给予外源性PTH处理,通过分析各组小鼠的骨骼表型,观察外源性PTH对FGFR3功能增强型点突变所致的软骨发育障碍的影响。此外,我们还初步观察了外源性PTH对FGFR3功能增强型点突变所致的骨折愈合延迟的影响。 主要实验方法: 第一部分:外源性PTH1-34对FGFR3G369C/+小鼠骨骼生长抑制的影响 采用X线摄影、全骨架染色和头颅局部摄影,观察小鼠大体形态及颅底软骨联结的变化情况,测定小鼠生长过程中体重、体长等的变化。 1.动物模型:采用新出生生当日的WT及ACH小鼠,分别随机分为给药组与对照组,给药组给予80μg/(kg·d) PTH1-34皮下注射,对照组给予等量注射用水直至观察期结束; 2.制备了不同年龄不同组别小鼠的组织切片,通过HE、藏红固绿染色观察生长板形态和第二骨化中心的发育情况;通过BrdU掺入后免疫组化检测,观察生长板软骨细胞增殖情况; 3.测量小鼠生长板肥大带的宽度,采用定量PCR检测软骨组织COL2A1、COL10A1和PTHrP的表达情况; 4.建立胎鼠胫骨及跖骨体外培养模型;采用PTH1-34间断处理培养的野生、突变(ACH)小鼠趾骨,观测其对跖骨生长的影响; 5.PTH处理培养的原代软骨细胞,观察其增殖分化的改变以及对FGFR3表达水平的影响。 第二部分:外源性PTH1-34对FGFR3G369C/+小鼠骨折愈合延迟的影响 1.制作小鼠胫骨近端稳定骨折模型,各基因型分别随机分为给药组与对照组,术后当日起给药组给予80μg/(kg·d) PTH1-34皮下注射,对照组给予等量注射用水直至观察期结束; 2.利用X线摄片和藏红固绿染色观察骨折愈合情况; 3.检测小鼠血清钙、磷含量; 4.检测骨痂中软骨细胞分化相关基因COL2A1、COL10A1、PTHrP和成骨相关的基因cbfa-1和OCmRNA变化观察软骨分化情况。 主要实验结果: 一、外源性PTH1-34可部分缓解FGFR3功能增强所致的骨骼生长抑制 (一)对FGFR3功能增强型点突变小鼠一般生长情况的影响 在观测期1 w-8 w内,给予PTH1-34的ACH小鼠体重、鼻-肛门长度增长较对照ACH小鼠明显;颅底软骨连接提前闭合有所改善;枕骨大孔狭窄无明显改善。 (二)对FGFR3功能增强型点突变小鼠软骨内成骨的影响 1.BrdU掺入检测后发现,给予PTH1-34的ACH小鼠软骨细胞增殖指数较对照ACH小鼠高;P16给予PTH1-34的ACH小鼠生长板软骨细胞增殖带较ACH宽;原代软骨细胞培养细胞计数与MTT检测发现给予PTH1-34处理的ACH小鼠软骨细胞增殖活性增强。 2.观察出生14 d小鼠的生长板,发现给予PTH1-34的ACH小鼠的第二骨化中心较ACH对照小鼠的提前出现,P7、P10,给予PTH1-34的ACH小鼠生长板肥大带明显较ACH对照小鼠增宽;荧光定量PCR提示:给予PTH1-34的ACH小鼠生长板软骨及原代细胞的COL10A1 mRNA表达水平较ACH-小鼠高。 (四)胚胎跖骨培养 建立了跖骨体外培养7 d的模型,ACH胎鼠(E16.5)跖骨在给予PTH1-34间断处理后提示:处理组跖骨生长率明显较未处理组高,主要增长的是软骨区域,提示:间断PTH1-34处理可促进软骨生长。 (五)可能机制的研究 外源性PTH1-34处理原代软骨细胞后FGFR3的mRNA及蛋白质水平均降低。 二、外源性PTH1-34可部分缓解FGFR3功能增强所致的骨折愈合延迟 1.X光摄片提示给药组骨痂密度和骨连接程度较对照组高:骨折14天,ACH对照组小鼠骨痂较处理组小,而且钙化密度较低;骨折28天,ACH对照小鼠骨折线隐约可见,而ACH给药组小鼠骨折基本愈合; 2.藏红固绿染色提示:骨折7天,给予PTH1-34的ACH小鼠骨痂中出现大量软骨,并且部分已进入肥大期;骨折14天,PTH1-34给药组ACH小鼠的软骨痂体积小于对照组;骨折21天,ACH对照组小鼠的骨痂中仍可见残留软骨组织,而ACH给药组小鼠中未见; 3.给予外源性PTH1-34对血清钙磷无明显影响,定量PCR提示,骨折早期,ACH给药组骨痂中的COL10A1 mRNA表达增高,PCNA mRNA表达增高;骨折中期,ACH给药组骨痂中的OC mRNA表达增高。 主要结论: 一、外源性PTH1-34可部分缓解FGFR3功能增强所致软骨发育不全 1.间断给予PTH1-34的ACH小鼠大体表型较ACH对照小鼠有所缓解; 2.间断给予PTH1-34可使ACH软骨细胞增殖活性较ACH对照小鼠增高; 3.间断给予PTH1-34可使ACH生长板软骨细胞分化较ACH对照小鼠有所改善; 4.间断给予PTH1-34处理可以促进小鼠跖骨生长; 5.间断给予PTH1-34处理促进软骨细胞的增殖分化可能与FGFR3的表达降低有关。 二、外源性PTH1-34可部分缓解FGFR3功能增强所致骨折愈合延迟 外源性PTH1-34可通过促进小鼠骨折早期软骨痂的形成及中后期软骨痂的改建,加速软骨向骨转化来改善ACH小鼠的骨折愈合延迟。


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