三维回转模拟失重对人牙周膜成纤维细胞生物学性能的影响

【摘要】：微重力环境可引起肌肉骨骼系统、心血管系统、免疫系统、神经-内分泌系统、自主平衡系统等各个系统的改变,如骨丢失、肌肉萎缩、心血管系统失调、立位耐受性下降、认知功能降低等等。那么,微重力环境对牙周组织会造成怎样的影响呢?在本研究中我们拟采用三维回转器(three dimensional clinostat,TDC)来模拟失重环境,从这种失重环境对人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts, hPDLFs)生物学性能的影响入手,对这一问题进行了探讨。 目的: 观察模拟失重环境对hPDLFs形态和功能的影响,初步探讨在这一特殊环境中工作、生活的个体(如宇航员、太空旅游者)的牙周组织对这种环境的耐受性。 方法: 取体外培养的4-7代hPDLFs,接种于20ml培养瓶贴壁24h,随机分为回转组和对照组。运用三维回转器(three dimensional clinostat,TDC)模拟失重环境,设定(4-10)r/min随机转速,所产生的重力水平在(10~(-3)-10~(-4) )g间。回转组hPDLFs在TDC中分别培养48h、72h和96h,对照组细胞分别在常规环境中培养。然后进行以下检测,比较分析两组间细胞的差异性。 1细胞形态学检测:利用HE染色、罗丹明-鬼笔环肽免疫荧光染色观察两组间细胞形态及细胞微丝骨架的变化。 2细胞功能检测:利用细胞计数法、MTT细胞活力检测、流式细胞术、Hoechst 33258核染色及RT-PCR技术,比较两组细胞间增殖、凋亡及I型胶原mRNA的表达等细胞功能的差异。 结果: 1 TDC模拟失重对hPDLFs细胞形态的影响 HE染色:培养48h后,回转组和对照组hPDLFs均呈梭形或多角形,细胞核大,居中,胞体丰满,胞浆均匀,未出现胞浆内颗粒增多、胞内空泡、核分叉、核碎裂等现象。但回转组细胞的胞核面积较对照组缩小约12%(P0.05);培养72h和96h后,回转组细胞形态与对照组比较无明显差异。 罗丹明-鬼笔环肽免疫荧光染色:培养48h后,回转组微丝骨架结构略显模糊,排列较对照组稍显紊乱。培养72h和96h后,回转组和对照组微丝骨架结构均呈现清晰而有规律的束状结构,分布均匀。 2 TDC模拟失重对hPDLFs细胞功能的影响 细胞计数仪计数:培养48h和72h后,回转组与对照组hPDLFs细胞数量无明显差异(P0.05);培养96h后,回转组与对照组细胞计数结果有显著差异,回转组细胞数量明显高于对照组(P0.01)。 MTT细胞活力检测:培养48h后,回转组与对照组细胞活力无明显差异(P0.05);培养72h和96h后,回转组细胞活力明显高于对照组(P0.01)。 细胞周期:培养48h和72h后,回转组与对照组细胞周期S期所占总周期的百分比例结果无明显差异(P0.05);模拟失重培养96h后,回转组细胞周期S期所占总周期的百分比例高于对照组(P0.05)。 Hoechst 33258核染色:培养48h、72h和96h后,回转组和对照组hPDLFs细胞核均呈弥散均匀荧光,细胞核边缘光滑圆润,未出现细胞核固缩、核碎裂、浓染致密的颗粒块状凋亡小体荧光。 RT-PCR:培养48h和72h后,回转组hPDLFsⅠ型胶原mRNA表达较对照组变化不明显(P0.05);培养96h后,回转组hPDLFsⅠ型胶原mRNA表达有所升高(P0.05)。 结论: 暴露于微重力环境的初期(48h),hPDLFs表现出细胞核变小、微丝骨架结构稍显紊乱的形态学变化,但未出现细胞裂解、凋亡增强、细胞活性下降等破坏性变化。随着在微重力环境中暴露时间的延长(72h、96h),hPDLFs细胞形态恢复正常,并且逐渐表现出细胞活力、增殖能力及Ⅰ型胶原表达增强的功能状态。这一结果提示,hPDLFs对短期(96h)的微重力环境具有耐受性,但其所表现出的功能活动增强的情况会对牙周组织结构产生何种影响,尚需进一步的研究进行探讨。