大鼠睾丸Smad1,Smad2,Smad4和Smad5蛋白的表达与发育变化研究

【摘要】： 睾丸是产生精子、维持性征的重要器官，出生后睾丸的发育成 熟、各种细胞的功能分化以及精子发生都受到诸如促性腺激素释 放激素（GnRH）、促甲状腺激素释放激素（TRH）、胰岛素样生长 因子（IGFs）、内皮素（ET）、血管紧张素-Ⅱ（AT-Ⅱ）等多种肽 类因子的调控，其中转化生长因子-β（Transforming growth factor β，TGF-β）超家族即是其中一类重要的睾丸功能局部调节因子。 TGF-β超家族是一个由分泌型的多肽分子，包括TGF-βs、活 化素（Activins）、抑制素（Inhibins）、骨形态形成蛋白（Bone morphogenetic proteins, BMPs）等构成的细胞因子超家族，在生物 机体及各个器官的发育过程中起重要的作用。TGF-β通过跨膜的 一 1型和＊型丝氨酸／苏氨酸激酶受体形成异源受体复合物，并使I 型受体活化，通过Smads通路传递信号。Smads蛋白是近年发现 的TGFo超家族下游一类细胞内信号转导分子，可将信号直接从 细胞膜转导入细胞核内，具有转录活化的作用。Smads编码42—60 kD的蛋白质，由两段高度保守的氢基端和叛基端结构域（MH 和MHZ）和中间富含脯氨酸的高变连接区组成。根据其结构和功 能特性分为三类：第一类受体激活的Smads或通路限制性Smads （Receptor－regulated Smads，R－Smads／Pathway－restricted Smads）， 它们的 C端结构域末端含有一个保守的磷酸化位点 SS（V／M）S， 可与1型受体直接作用并被磷酸化。这一类Smads在特定的 TGFB超家族成员介导的信号转导通路中发挥作用，如：BMPs 通过Smadl、Smads和Smads，TGFB和活化素通过SmadZ和 Smad3。第二类为通用的 Smads（Common－mediator Smads， Co．Smads），目前在脊椎动物发现的此类 Smad只有 Smad4。在它 的C端结构域没有磷酸化位点，但它可与其它R－Smads相互作用 并形成稳定的异源三聚体。这种异源三聚体的形成是信号得以转 导所必需的。第三类为抑朱性 Smads（Inhibitory Smads，I－Smads）， 包括Smad6和Smad7，它们能够通过阻断R刁mads与受体或 Co．Smads的结合，对Smads的信号转导通路发挥负调控作用。 目前已证实TGF p超家族成员及其受体在辜丸中均有表达， 无论是在分裂期生精细胞，还是在支持细胞、间质细胞都有它们 的存在，且与特殊的生精细胞时相门tage）有关。目前有关 TGF－ p超家族成员在精子发生和发育过程中的作用还不清楚，因此从 其信号转导的下游分子Smads的研究入手，进一步弄清其作用机 理和途径尤为重要。本研究分别取自出生后3天、7天、14天、 2 —— 28天和成年的健康雄性S＊大鼠睾丸，应用免疫组织化学ABC 法结合葡萄糖氧化酶－DAB－硫酸镍铰增强技术，检测发育不同阶 段大鼠摹丸Smadl、SmadZ、Smad4和Smads蛋白的定位和发育 变化，并通过图像分析技术对免疫组织化学结果进行定量分析； 应用抗CD 14一抗Smad4及抗SmadZ一抗Smad4双重免疫染色技 术，检测成年大鼠睾丸Smads蛋白的共存现象；应用PAS反应， 显示成年大鼠睾丸生精上皮的不同时相（StageX应用蛋白质兔疫 印迹技术，检测发育不同阶段大鼠睾丸四种Smads蛋白的表达、 变化。 结果表明： 1．Smadl 在出主后14天大鼠睾丸的主精细胞中即可见兔疫 阳性反应，胞核为阴性，支持细胞及间质细胞未见阳性反应； Western－blots则从生后3天起，在发育的各个阶段均有表达。 2．SmadZ从出生后7天起开始表达，免疫阳性产物位于各级 生精细胞的胞质内，支持细胞及间质细胞亦有阳性反应； Western．blots结果从生后3天起，在大鼠睾丸发育的各个阶段均 有表达。 3．Smad4的免疫组化及 Western－blots结果均显示，发育各个 阶段的间质细胞中都有较强的表达，免疫阳性产物位于细胞质内， 而各级生精细胞则无阳性反应。 4．Smads的免疫组化及Western－blots结果显示，仅在28夭 和成年大鼠的间质细胞胞质内有弱的表达，各级生精细胞未见阳 性反应。 5．图像分析及统计结果提示，Smadl、SmadZ、Smad4和Smads 蛋白均随着大鼠宰丸的发育成熟有一个逐渐增多的变化趋势。 3 一 6．PAS反应及免疫组化结果提示，Smad、SmadZ蛋白表达 于各级生精细胞中，其阳性分布趋势与生精小管的生精上皮所处 周期（Circle）的不同时相（Stage）有关。 由此我们的推论是： 1．Smads在促进和维持睾丸组织的发育成熟、各种细胞的