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细胞外pH值对培养的主动脉平滑肌细胞膜电位及钾通道活动的影响

宋莉莉  
【摘要】: 酸碱平衡是人体维持内环境稳定的一个重要因素。正常细胞外 液pH值(pH_o)为7.35-7.45。在一些病理或生理条件下,如组织缺 氧、酸中毒或碱中毒等,pH_o可在6.5~8.1之间波动,并由此引发血 管张力的改变。pH_o引起的血管张力改变,在不同组织,不同血管节 段的表现也不同,如在肺动脉,pH_o降低使之收缩,而在脑血管中, pH_o的降低则导致血管的舒张,其机制还未完全明了。有人认为pH_o是 通过改变内皮源性血管活性物质的释放而影响血管的舒缩状态的;也 有人认为pH_o是通过细胞内pH值(pH_i)影响细胞代谢及信号传递途 径从而改变血管平滑肌细胞张力的;还有实验表明pH_o可以直接作用 于血管平滑肌细胞,改变其舒缩状态从而调节血管张力,这种作用与 血管平滑肌细胞上钾通道的功能状态有密切的关系。目前对pH_o影响 肺、脑及肠系膜等阻力血管张力的研究较多,pH_o调节大血管张力的 机制,尤其是离子机制还不明了。 为了进一步探究pH_o调节血管张力的离子机制,本实验以主动脉 平滑肌细胞为实验对象,采用细胞培养及全细胞膜片钳技术,研究pH_o 的改变对主动脉平滑肌细胞上钾通道活动的影响。本实验是国家自然 科学基金《流量依赖性血管张力调节的离子机制研究》(39800226) 中的一部分,为进一步通过细胞共培养技术研究pH_o调节血管张力的 机制奠定了基础。 实验方法 1、采用组织块法培养SD大鼠乳鼠的主动脉平滑肌细胞,通过 免疫组织化学方法进行鉴定。此外,应用消化法培养了小牛主动脉、 肺动脉的内皮细胞和乳鼠脑微血管内皮细胞。为下一步研究血管异质 性对pH_o引起血管张力改变的影响作好准备。 2、采用全细胞膜片钳技术检测SD大鼠乳鼠主动脉平滑肌细胞 第四军医大学航空临床医学教研室 硕士学位论文 的膜电位及钾通道的活动情况,钳制电压660mV,阶越电压为 10mV, 共 13个刺激电压,刺激电压从660mV~+60mV。并应用钾通道特异 性阻断剂(如 TEA、4AP等)确定钾通道的类型。采用全细胞膜片 钳技术记录视网膜微血管内皮细胞株RF历A的膜电位及进行膜上电 流观察。 3、采用全细胞膜片钳技术研究p民的急、慢性改变对乳鼠主动 脉平滑肌细胞上钾通道功能状态的影响。()急性pH。改变:使细胞 顺次暴露于pH7.2-pH6.5一pH7.2的细胞外液中,或是pH7.2~pHS.1 一PH7.2的细胞外液中。(2)慢性PHo改变:将细胞原代培养于CO。 浓度为8.8%的孵箱中,第7天进行传代,取第8天(传代后第2夭) 的细胞,进行膜片钳实验。在另一些实验中,细胞外液中包含TEA 门)或4APu L 观察对电流改变的影响,从而确定所涉 及的通道类型。 实验结果 1、成功培养并鉴定了乳鼠主动脉平滑肌细胞、小牛主、肺动脉 内皮细胞及乳鼠脑微血管内皮细胞。 2、用全细胞膜片钳记录的电流钳制方式测得SD大鼠7日龄乳鼠 主动脉平滑肌细胞的静息膜电位为上7土smV(n=30人 观察到SMC 上主要存在的钾通道电流为 K山,对 TEA门)敏感,对 4-APu) 不敏感。ACh对该通道电流无明显作用。RF/6A细胞膜电位有两个高 峰,峰值约为毛5mV和巧5mV。膜上存在三种钾通道电流:钙激活性 钾通道(Ko\瞬时外向性钾通道(K/及内向整流性钾通道(K;*。 3、在急性PH。改变中,PHo减低使主动脉平滑肌细胞膜超极化, 钾电流增大。而升高则使膜去极化,钾电流减小。TEA门)能 够阻断这种改变,而4AP(smM)对此没有影响。在慢性实验中, 孵箱中CO。浓度升高使膜去极化,钾电流减小。 结论 实验观察到SD大鼠乳鼠主动脉平滑肌细胞上主要存在的钾通道 .3. 第四军医大学航空临床医学教研室 硕士学位论文 为K门通道,在个别细胞上见到Kv通道。这可能与物种及年龄有关, 也是血管异质性在离子水平上的表现。pH。改变引起钾电流及膜电位 的变化,提示p民影响血管张力的机制之一是通过改变其平滑肌细胞 上钾通道活动来实现的。而急、慢性pH。降低对钾电流的作用相反, 可能是因为pH;的介入改变了细胞的代谢状态,或是细胞的一种适应 性反应。


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