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重组人Ⅱ型胶原250-270多肽的基因构建和表达的研究

王宏坤  
【摘要】: 类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种自身免疫性疾 病,Ⅱ型胶蛋白(type Ⅱ collagen,CⅡ)是RA的自身抗原之一,在疾 病发展和治疗研究中都有重要的作用。为了成功地高效表达和分离纯化重 组人Ⅱ型胶原蛋白250-270多肽(recombinant human collagen type Ⅱ peptide 250-270,rhCⅡ250-270),为口服耐受治疗RA的基础和临床研究 提供大量可用的研究材料,本文采用DNA合成、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)、重组DNA技术、DNA序列测定、亲和层析等技术方 法,成功构建rhCⅡ250-270的多聚目的基因,研究其在大肠杆菌 (escherichia coli,E.coli)中的表达条件,并分离纯化获得所需的表 达产物。主要研究内容如下: 本文为高效表达rhCⅡ250-270,在基因构建时,就采取了一些方法对 目的基因进行优化。采用E.coli偏爱密码子,通过化学合成和PCR技术, 第四军医大学硕士学位论文 构建rhC 11 250-270的目的基固,并重组到pUC19质粒中,测序结果证实目 的基因序列与设计的完全相同;利用同裂酶 salnHI和 Bgl 11相同的粘性末 端,将单聚目的基因片段在重组质粒上依次串联成多聚目的基因,测序结 果证实多聚目的基因序列与预期的相符。 在表达研究中,通过比较 rbC 11 250-27D在不同类型的表达载体上及不 同 E COil宿主菌中的表达量,发现以非融合方式表达时,无论是化学诱导 (PKKH)或温控诱导(PBV220),在不同宿主菌中表达量都很低,且表达产 物的可溶性很差;YX融合方式表达一GEX叶T-1和 PGEX一T七)时,表达量 明显提高,表达产物的可溶性较好,但在不同宿主菌中的差异很大。选择 融合表达的 BLZIL程菌进行表达条件的优化研究,发现培养温度对表达量 的影响最大。在优化的条件进行表达下,SDS干AGE结果显示,表达产物大 。J、约为43kD,与预期的相符,表达量约为30%,可溶性在80%以上。利用 GST亲和层析法对表达产物进行纯化,纯化后的融合蛋白纯度可达90%以上。 本研究是首次利用基固工程的方法对人 11型胶原蛋白(HllC 11)的功能 性多肽进行重组表达和分离纯化,并对胶原蛋白在原核细胞中的表达条件 进行了初步模索,为以后的同类研究提供了经验。同时,本研究也为口服 耐受治疗RA的基础和临床研究提供大量的研究材料。


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