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人牙髓细胞内Smad2、3在TGF-β1信号转导中作用的研究

包柳郁  
【摘要】: 成牙本质细胞的诱导分化是牙髓损伤修复和牙胚发育的关键环节,也是牙 髓生物学的一项重要研究内容。许多生长因子参与了成牙本质细胞分化的信号 启动过程,其中TGF-β的作用尤为突出。TGF-β不仅可以诱导成牙本质细胞 发生功能性分化,而且具有调控其合成和分泌牙本质基质的能力。但TGF-β 在牙髓损伤修复和牙胚发育中作用的分子机制,即其在成牙本质细胞和牙髓细 胞内的信号转导途径以及对基因表达的调控方式,目前尚不十分清楚。 1996年,有学者从人肾组织cDNA文库中克隆成功一种新基因,称为 Smad2。研究证实,Smad2基因所编码的蛋白质可转导TGF-β信号。迄今为 止,已克隆成功Smad1-9,形成Smads家族,其中Smad2和Smad3是TGF- β特异的细胞内信号转导分子,该分子在被TGF-βⅠ型受体磷酸化后可将 TGF-β的信号向核内传递,调控目的基因的表达。已有研究证实,人牙髓细胞 内存在Smad2基因的表达,但有关Smad2和Smad3在TGF-β调控牙髓损伤 修复和牙胚发育过程中的作用,国内外尚未见报道。 本研究的目的是观察人牙髓细胞内Smad2和Smad3分子在TGF-β1信号 转导中的作用,以及TGF-β1对二者表达水平的调控方式,并检测Smad2和 Smad3在牙胚发育的不同时期和正常、龋坏、炎症牙髓组织中的表达及其变化, 旨在从细胞内信号转导水平探讨TGF-β调节成牙本质细胞分化和牙本质形成 的分子机理,为揭示牙胚发育和牙髓损伤修复过程中基因表达的调控机制提供 一定的实验依据。本研究分为四个部分: 1.人牙髓细胞(HDPC)内Smad2和Smad3转导TGF-β1信号的激光共聚 焦显微镜(LSCM)观察 取生长良好的第5代HDPC,用5ng/ml TGF-β1或200ng/mlBMP2刺激并 培养15min、30min、1h、2h,设对照组(不予刺激)。将各组标本分别进行Smad2 第四军医大学硕士学位论文 和Smad3兔疫荧光染色,在LSCM下观察并照相。结果:TGF-pl刺激组可 见刺激Zh之内,SmadZ和Smad3在胞浆中的表达不断减弱,而在胞核内的表 达逐渐增强,呈现由胞浆向胞核逐步转位的趋势,而BMPZ刺激组及对照组未 见此现象。 2.TGF-PI作用下人牙髓细胞内 SmadZ和 Smad3蛋白表达水平的变化 取生长良好的第 5代Il3PC,分为实验组和对照组,实验组用 sghl TGF- el刺激并培养6、12、24、48h,对照组不予刺激。提取各组总蛋白质,分别 用SmadZ或Smad3抗体进行Western印迹杂交。结果显示:与对照组相比, Smad3在 TGF卡 刺激后 6h及 12h,其蛋白表达量无明显变化,而在刺激后 24h表达量明显下降,刺激48h后表达十分微弱;SmadZ在对照组及刺激后各 时间点组,其蛋白表达量无显著变化。 3.SmadZ和Smad3在人牙髓组织中的分布与表达 制备正常、龋坏及炎症人牙髓组织标本,采用免疫组化方法检测SmadZ 和Smad3在不同类型牙髓组织中的分布与表达。结果:SmadZ和Smad3在正 常和龋坏牙髓的成牙本质细胞层呈强阳性表达,在下方的富细胞区为阳性表 达,牙髓中心部细胞内为弱阳性表达,炎症牙髓浸润的炎细胞中SmadZ和 Smad3呈强阳性表达。Smad3在各类牙髓中的表达模式与SmadZ基本一致, 只是染色浅于SmadZ。 4.人牙胚发育过程中SmadZ和Smad3的表达及其变化 制备不同发育时期的人牙胚标本,运用免疫组化方法观察SmadZ和Smad3 在各期牙胚的表达分布和表达变化。结果:SInadZ和Smad3在人牙胚发育的 不同时期均有表达,但在各期的分布模式不尽相同,总的趋势是随着成釉细胞 和成牙本质细胞的分化成熟,其表达逐渐增强。SmadZ和Smad3在不同发育 时期牙胚中的分布与TGF-p有相似之处。各期牙胚中SmadZ和Smad3的表达 部位基本相同,但SmadZ着色较Smad3强。 本研究运用LSCM观察到TGF-pl作用下SmadZ和Smad3在人牙髓细胞 内的定位变化过程,结果表明,Smad和Smad3能特异地转导TGF-61信号 ·4· 第四军医大学硕士学位论文 至核内而发挥作用,是TGF-PI信号转导机制中的关键分子,TGF-PI可能是 通过SmadZ或Smad3信号转导途径实现对牙髓细胞分化的调节。同时,采用 Western blot方法观察 TGF-pl作用下人牙髓细胞内 SmadZ和 Smad3蛋白表达 水平的变化,结果提示,TGF-pl在刺激初期并不引起SmadZ和Smad3表达 量的变化,可能主要通过使二者发生磷酸化而启动其胞内信号转导过程,末期 TGF.pl又通过下调Smad3的表达水平,及时终止自身的信号转导,此时SmadZ 的表达仍无变化。推测Smad3可能在TGF.p用MAD信号转导途径的负反馈调 节中起重要作用。本文还采用免疫组化方法检测SmadZ和Smad3在不同发育 时期的牙胚和正常、龋坏、炎症牙髓组织中的表达及其变化,结果提示SmadZ 和Smad3可能在TGF-p调节牙胚发育和牙髓损伤修复的信号转导机制中起一 定的作用。本研究为阐明TGF-e调控成牙本质细胞分化和牙本质形成的分子 机制提供了可靠的实验依据,并为深人研究TGF p在牙?


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