人牙髓细胞内Smad2、3在TGF-β1信号转导中作用的研究

【摘要】： 成牙本质细胞的诱导分化是牙髓损伤修复和牙胚发育的关键环节，也是牙 髓生物学的一项重要研究内容。许多生长因子参与了成牙本质细胞分化的信号 启动过程，其中TGF-β的作用尤为突出。TGF-β不仅可以诱导成牙本质细胞 发生功能性分化，而且具有调控其合成和分泌牙本质基质的能力。但TGF-β 在牙髓损伤修复和牙胚发育中作用的分子机制，即其在成牙本质细胞和牙髓细 胞内的信号转导途径以及对基因表达的调控方式，目前尚不十分清楚。 1996年，有学者从人肾组织cDNA文库中克隆成功一种新基因，称为 Smad2。研究证实，Smad2基因所编码的蛋白质可转导TGF-β信号。迄今为 止，已克隆成功Smad1-9，形成Smads家族，其中Smad2和Smad3是TGF- β特异的细胞内信号转导分子，该分子在被TGF-βⅠ型受体磷酸化后可将 TGF-β的信号向核内传递，调控目的基因的表达。已有研究证实，人牙髓细胞 内存在Smad2基因的表达，但有关Smad2和Smad3在TGF-β调控牙髓损伤 修复和牙胚发育过程中的作用，国内外尚未见报道。 本研究的目的是观察人牙髓细胞内Smad2和Smad3分子在TGF-β1信号 转导中的作用，以及TGF-β1对二者表达水平的调控方式，并检测Smad2和 Smad3在牙胚发育的不同时期和正常、龋坏、炎症牙髓组织中的表达及其变化， 旨在从细胞内信号转导水平探讨TGF-β调节成牙本质细胞分化和牙本质形成 的分子机理，为揭示牙胚发育和牙髓损伤修复过程中基因表达的调控机制提供 一定的实验依据。本研究分为四个部分： 1．人牙髓细胞（HDPC）内Smad2和Smad3转导TGF-β1信号的激光共聚 焦显微镜（LSCM）观察 取生长良好的第5代HDPC，用5ng/ml TGF-β1或200ng/mlBMP2刺激并 培养15min、30min、1h、2h，设对照组（不予刺激）。将各组标本分别进行Smad2 第四军医大学硕士学位论文 和Smad3兔疫荧光染色，在LSCM下观察并照相。结果：TGF－pl刺激组可 见刺激Zh之内，SmadZ和Smad3在胞浆中的表达不断减弱，而在胞核内的表 达逐渐增强，呈现由胞浆向胞核逐步转位的趋势，而BMPZ刺激组及对照组未 见此现象。 2．TGF－PI作用下人牙髓细胞内 SmadZ和 Smad3蛋白表达水平的变化 取生长良好的第 5代Il3PC，分为实验组和对照组，实验组用 sghl TGF－ el刺激并培养6、12、24、48h，对照组不予刺激。提取各组总蛋白质，分别 用SmadZ或Smad3抗体进行Western印迹杂交。结果显示：与对照组相比， Smad3在 TGF卡 刺激后 6h及 12h，其蛋白表达量无明显变化，而在刺激后 24h表达量明显下降，刺激48h后表达十分微弱；SmadZ在对照组及刺激后各 时间点组，其蛋白表达量无显著变化。 3．SmadZ和Smad3在人牙髓组织中的分布与表达 制备正常、龋坏及炎症人牙髓组织标本，采用免疫组化方法检测SmadZ 和Smad3在不同类型牙髓组织中的分布与表达。结果：SmadZ和Smad3在正 常和龋坏牙髓的成牙本质细胞层呈强阳性表达，在下方的富细胞区为阳性表 达，牙髓中心部细胞内为弱阳性表达，炎症牙髓浸润的炎细胞中SmadZ和 Smad3呈强阳性表达。Smad3在各类牙髓中的表达模式与SmadZ基本一致， 只是染色浅于SmadZ。 4．人牙胚发育过程中SmadZ和Smad3的表达及其变化 制备不同发育时期的人牙胚标本，运用免疫组化方法观察SmadZ和Smad3 在各期牙胚的表达分布和表达变化。结果：SInadZ和Smad3在人牙胚发育的 不同时期均有表达，但在各期的分布模式不尽相同，总的趋势是随着成釉细胞 和成牙本质细胞的分化成熟，其表达逐渐增强。SmadZ和Smad3在不同发育 时期牙胚中的分布与TGF－p有相似之处。各期牙胚中SmadZ和Smad3的表达 部位基本相同，但SmadZ着色较Smad3强。 本研究运用LSCM观察到TGF－pl作用下SmadZ和Smad3在人牙髓细胞 内的定位变化过程，结果表明，Smad和Smad3能特异地转导TGF－61信号 ·4· 第四军医大学硕士学位论文 至核内而发挥作用，是TGF－PI信号转导机制中的关键分子，TGF－PI可能是 通过SmadZ或Smad3信号转导途径实现对牙髓细胞分化的调节。同时，采用 Western blot方法观察 TGF－pl作用下人牙髓细胞内 SmadZ和 Smad3蛋白表达 水平的变化，结果提示，TGF－pl在刺激初期并不引起SmadZ和Smad3表达 量的变化，可能主要通过使二者发生磷酸化而启动其胞内信号转导过程，末期 TGF．pl又通过下调Smad3的表达水平，及时终止自身的信号转导，此时SmadZ 的表达仍无变化。推测Smad3可能在TGF．p用MAD信号转导途径的负反馈调 节中起重要作用。本文还采用免疫组化方法检测SmadZ和Smad3在不同发育 时期的牙胚和正常、龋坏、炎症牙髓组织中的表达及其变化，结果提示SmadZ 和Smad3可能在TGF－p调节牙胚发育和牙髓损伤修复的信号转导机制中起一 定的作用。本研究为阐明TGF－e调控成牙本质细胞分化和牙本质形成的分子 机制提供了可靠的实验依据，并为深人研究TGF p在牙?