人牙乳头细胞内Smad5、6在BMP2信号转导中作用的研究

【摘要】： 龋病、牙髓病、牙齿发育异常为口腔常见病、多发病，主要的危害是 引起牙体牙髓损伤，甚至导致牙齿松动、脱落。因而阐明牙髓组织的损伤 修复机制及牙胚发育发生机制是口腔内科学研究的热点问题。成牙本质细 胞分化是牙体牙髓损伤修复过程中的关键环节，也是牙胚发育过程中的重 要阶段。 骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）属于TGF-β细胞因子 超家族，在细胞生长、分化、凋亡和机体各种组织、器官形态发生中起重 要的调控作用。在牙髓生物学领域，BMP在牙胚发育、成牙本质细胞的分 化和牙髓损伤修复过程中的作用受到国内外学者的关注。研究结果表明， BMP作为上皮释放的一种信号分子参与调控牙胚发育和成牙本质细胞分 化。由于成牙本质细胞在牙齿矿化、牙髓损伤修复过程中发挥重要的作用， 其分化机制是当今牙髓生物学重要的研究课题之一。牙乳头细胞（human dental papilla cells，HDPC）是牙胚发育过程中具有分化形成成牙本质细胞潜 能的间充质细胞群，因此牙乳头细胞常作为研究成牙本质细胞分化过程及 机制的实验模型。研究牙乳头细胞内BMP2调控信号转导途径，为阐明BMP 在成牙本质细胞分化、牙本质形成和矿化过程中的作用，揭示牙髓组织的 损伤修复机制以及牙胚发育发生机制提供一定的理论和实验依据。 1996年，Hoodless克隆发现了Smadl信号分子，并在此基础上成功克 隆了Smad5、6，使BMP的信号转导途径获得突破性的进展。研究证实，Smad5 是BMP受体下游的信号分子，它能特异的转导BMP的信号至细胞核内， 发挥基因的调控作用，Smad6是BMP信号转导过程中的抑制分子，它通过 与细胞表面BMPⅠ型受体竞争结合，对Smad5信号转导过程起抑制作用。 第四军 硕士学位论文 目前，有掰胚发育过程中和瓜乳头细胞中是否存在Smads、6的表达， 及其对BMPZ调控牙胚发育和牙乳头分化过程中的影响，国内外尚未见报 道。 本研究目的是鹏大硼厨胚发育腑中是否存在Smads、6的表达 及变化；鹏瓜乳头细胞内是否存在Smads、6的表达、及在BMPZ刺 激作用下Smads、6能否特异地转导BMPZ信号；以及人牙乳头细胞内 Smads、6蛋白表达量与BMPZ的关系，从细胞内信号转导水平删BMPZ 调控牙乳头细胞分化机理和钙化的分子机制。本研究分三个实验： 1．Smads、6在大鼠及人牙胚发育过程中甜的研究 采用连续的大鼠和人牙胚的切片，进行常规兔疫组化染色。结果： Smads在大鼠牙胚发育硼呈现不同时空的越： 帽状期：Smads在成釉器内釉上皮细胞呈强阳性表达，外釉上皮星网 状层细胞呈阴性表达，牙囊、牙乳头细胞呈阳性表达。 钟状早期：内釉上皮细胞呈强阳性表达，中间层细胞阳性表达，牙乳 头细胞呈弱阳性表达。 钟状晚期：成釉细胞、成牙本质细胞呈强阳性表达，牙乳头细胞呈阳 性表达。 Smads在人牙胚发育各期呈现不同时空的表达 蕾撇：在牙板和翩器为阳性表达。 钟状早期：内釉上皮细胞呈强阳性表达，中间层细胞阳性表达，牙乳 头细胞呈弱阳性表达。 钟状晚期：成釉细胞、成牙本质细胞呈强阳性表达，牙乳头细胞呈阳 性表达。 Smad6 t鼠和人牙胚发育溯的表达部位与Smads相同，侄Q臼良达 均弱于s——ds。 3 第四军医大学硕士学位论文 工BMPZ作用下瓜乳头细胞内Smads。6的转位变化的研究 贻5代Il3PC，制备细娜片，分为三组，100ng／Inl BWZ刺激组， 2．sng／ml TGF下 刺激组和对照组，刺激培养 lh，4％多聚甲醛固定 30min 后，常规免疫组化染色。结果：对照组Smads、6位于胞浆，胞核未见阳性 染色；TGF下 组与对照组无显著差异，Smads、6位于胞浆，胞核未见阳 性染色；BMPZ组胞核Smads强阳性染色，胞浆弱阳性染色，Smad胞浆 强阳性染色，细胞核未见阳性染色，。 3．BMPZ作用下厨乳头细胞内Smads、6蛋白质表达变化的研究 取第 5代 HDPC细胞，分另用含有或不含有 100ng／Inl BMPZ刺激培养 6h、12h、2奶、48h后，提取总蛋白质。用 Smads（l：200）和 Sm刎6抗体（l：300） 进行Western印迹杂交。结果：HDPC在BMPZ刺激作用48h内，细胞内Smads 的蛋白表达量未见明显变化；Smad6的蛋白表达量在BMPZ刺激作用6h内 可见蛋白量的明显增加，胳时间段内未见明显变化。 本研究观察到Smads、6在大鼠和人牙胚各期的发育同时存在表达，而 且呈一定的时空分布。结果表明Smads、6在牙胚中的肺与BMPs在牙胚 中的分布有相似视，Smads和Smad6的同时出现表明在BMPS、6 调控牙胚发育的过程中可能存在一个完整的反馈系统，B硼可能通过 Smads、6精确地调控下游目的基因的表达。本研究还通过贩组化法，观 察Smads、6在BMPZ和TGF小 刺激作用下，Smads． 6的变化。结果表 明BMPZ，而不是TGF小，ggw导Smads从胞浆转位至核内聚集，颁