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人牙乳头细胞内Smad5、6在BMP2信号转导中作用的研究

臧晓霞  
【摘要】: 龋病、牙髓病、牙齿发育异常为口腔常见病、多发病,主要的危害是 引起牙体牙髓损伤,甚至导致牙齿松动、脱落。因而阐明牙髓组织的损伤 修复机制及牙胚发育发生机制是口腔内科学研究的热点问题。成牙本质细 胞分化是牙体牙髓损伤修复过程中的关键环节,也是牙胚发育过程中的重 要阶段。 骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)属于TGF-β细胞因子 超家族,在细胞生长、分化、凋亡和机体各种组织、器官形态发生中起重 要的调控作用。在牙髓生物学领域,BMP在牙胚发育、成牙本质细胞的分 化和牙髓损伤修复过程中的作用受到国内外学者的关注。研究结果表明, BMP作为上皮释放的一种信号分子参与调控牙胚发育和成牙本质细胞分 化。由于成牙本质细胞在牙齿矿化、牙髓损伤修复过程中发挥重要的作用, 其分化机制是当今牙髓生物学重要的研究课题之一。牙乳头细胞(human dental papilla cells,HDPC)是牙胚发育过程中具有分化形成成牙本质细胞潜 能的间充质细胞群,因此牙乳头细胞常作为研究成牙本质细胞分化过程及 机制的实验模型。研究牙乳头细胞内BMP2调控信号转导途径,为阐明BMP 在成牙本质细胞分化、牙本质形成和矿化过程中的作用,揭示牙髓组织的 损伤修复机制以及牙胚发育发生机制提供一定的理论和实验依据。 1996年,Hoodless克隆发现了Smadl信号分子,并在此基础上成功克 隆了Smad5、6,使BMP的信号转导途径获得突破性的进展。研究证实,Smad5 是BMP受体下游的信号分子,它能特异的转导BMP的信号至细胞核内, 发挥基因的调控作用,Smad6是BMP信号转导过程中的抑制分子,它通过 与细胞表面BMPⅠ型受体竞争结合,对Smad5信号转导过程起抑制作用。 第四军 硕士学位论文 目前,有掰胚发育过程中和瓜乳头细胞中是否存在Smads、6的表达, 及其对BMPZ调控牙胚发育和牙乳头分化过程中的影响,国内外尚未见报 道。 本研究目的是鹏大硼厨胚发育腑中是否存在Smads、6的表达 及变化;鹏瓜乳头细胞内是否存在Smads、6的表达、及在BMPZ刺 激作用下Smads、6能否特异地转导BMPZ信号;以及人牙乳头细胞内 Smads、6蛋白表达量与BMPZ的关系,从细胞内信号转导水平删BMPZ 调控牙乳头细胞分化机理和钙化的分子机制。本研究分三个实验: 1.Smads、6在大鼠及人牙胚发育过程中甜的研究 采用连续的大鼠和人牙胚的切片,进行常规兔疫组化染色。结果: Smads在大鼠牙胚发育硼呈现不同时空的越: 帽状期:Smads在成釉器内釉上皮细胞呈强阳性表达,外釉上皮星网 状层细胞呈阴性表达,牙囊、牙乳头细胞呈阳性表达。 钟状早期:内釉上皮细胞呈强阳性表达,中间层细胞阳性表达,牙乳 头细胞呈弱阳性表达。 钟状晚期:成釉细胞、成牙本质细胞呈强阳性表达,牙乳头细胞呈阳 性表达。 Smads在人牙胚发育各期呈现不同时空的表达 蕾撇:在牙板和翩器为阳性表达。 钟状早期:内釉上皮细胞呈强阳性表达,中间层细胞阳性表达,牙乳 头细胞呈弱阳性表达。 钟状晚期:成釉细胞、成牙本质细胞呈强阳性表达,牙乳头细胞呈阳 性表达。 Smad6 t鼠和人牙胚发育溯的表达部位与Smads相同,侄Q臼良达 均弱于s——ds。 3 第四军医大学硕士学位论文 工BMPZ作用下瓜乳头细胞内Smads。6的转位变化的研究 贻5代Il3PC,制备细娜片,分为三组,100ng/Inl BWZ刺激组, 2.sng/ml TGF下 刺激组和对照组,刺激培养 lh,4%多聚甲醛固定 30min 后,常规免疫组化染色。结果:对照组Smads、6位于胞浆,胞核未见阳性 染色;TGF下 组与对照组无显著差异,Smads、6位于胞浆,胞核未见阳 性染色;BMPZ组胞核Smads强阳性染色,胞浆弱阳性染色,Smad胞浆 强阳性染色,细胞核未见阳性染色,。 3.BMPZ作用下厨乳头细胞内Smads、6蛋白质表达变化的研究 取第 5代 HDPC细胞,分另用含有或不含有 100ng/Inl BMPZ刺激培养 6h、12h、2奶、48h后,提取总蛋白质。用 Smads(l:200)和 Sm刎6抗体(l:300) 进行Western印迹杂交。结果:HDPC在BMPZ刺激作用48h内,细胞内Smads 的蛋白表达量未见明显变化;Smad6的蛋白表达量在BMPZ刺激作用6h内 可见蛋白量的明显增加,胳时间段内未见明显变化。 本研究观察到Smads、6在大鼠和人牙胚各期的发育同时存在表达,而 且呈一定的时空分布。结果表明Smads、6在牙胚中的肺与BMPs在牙胚 中的分布有相似视,Smads和Smad6的同时出现表明在BMPS、6 调控牙胚发育的过程中可能存在一个完整的反馈系统,B硼可能通过 Smads、6精确地调控下游目的基因的表达。本研究还通过贩组化法,观 察Smads、6在BMPZ和TGF小 刺激作用下,Smads. 6的变化。结果表 明BMPZ,而不是TGF小,ggw导Smads从胞浆转位至核内聚集,颁


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