胃癌细胞耐药相关分子的表达、信号转导途径和离子通道特性的研究

【摘要】： 肿瘤的多药耐药已成为肿瘤治疗的一大难关。目前已发现多种多药耐药 相关分子，如Pgp、MRP、LRP、BCRP、GSH/GSH、TopoⅡ以及凋亡相关蛋白或 抗凋亡蛋白等，但这些还远不能圆满解释肿瘤多药耐药的发生机理。因此， 寻找新的耐药相关分子和逆转耐药的新途径已成为肿瘤研究的热点。1994年， 我所采用体外阶梯诱导的方法，将人胃癌细胞系SGC7901暴露于含长春新碱 的培养液中，经逐步诱导得到一株耐药细胞系SGC7901/VCR，其耐药浓度为 0.2ug/ml。研究表明，SGC7901/VCR稳定高表达Pgp、MGrlAg等耐药相关 分子，同时对多种化疗药物交叉耐药。提示SGC7901/VCR是一个在体外研 究胃癌多药耐药的较好模型。本研究拟以该细胞模型为基础，借助全细胞膜 片钳、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪等技术，对胃癌耐药细胞的离子通道 和信号转导途径进行研究，以期揭示新的耐药机制，并为寻找新的耐药逆转 措施奠定良好的理论基础。 目的：首先采用阶梯诱导法对已有的SGC7901/VCR细胞继续进行诱导， 建立不同耐药指数的耐药细胞亚系，并在此基础上：（1）观察PKC、PKA与 胃癌细胞耐药的相关性；（2）观察细胞耐药后离子通道的变化，以及信号转 导途径的调节；（3）观察本所研制的与耐药相关的单克隆抗体MGr1对胃癌 耐药细胞PKC活性的影响；（4）观察本所发现的胃癌相关抗原MG7Ag在耐 药细胞亚系与亲本细胞的表达差异，以及对细胞内药物浓度的影响。 方法：（1）用体外阶梯诱导的方法建立不同耐药指数的胃癌耐药细胞亚 第四军医大学博士学位论文 一 系，并利用免疫细胞化学及流式细胞仪方法进行兔疫学鉴定；门）用兔疫细 胞化学及免疫蛋白印迹方法检测PKC的表达，用竟争蛋白结合法检测PKC、 PKA活性的变化；O）采用 Mh’实验观察 PKC的激活剂和抑制剂对胃癌耐 药细胞药物敏感性的影响，采用流式细胞仪检测PKC的激活剂和抑制剂对胃 癌耐药细胞胞内药物蓄积的影响：N）用免疫荧光双标记及共聚焦显微镜技 －术观察PKC与MGrlAg在耐药及药敏细胞的相关表达；u）用穿孔膜片钳方 法观察细胞耐药后离子通道的变化及信号转导途径的调节；（6）采用免疫荧 光化学方法观察肿胀激活状态下P＊C同工酶亚型的亚细胞分布变化：（）采 用钾通道KVI．5及KvZ＊的多克隆抗体，用免疫细胞化学方法检测KVI．5及 KVZ．1 的表达；（8）用流式细胞仪观测钾通道阻断剂对细胞内药物浓度的影 响；①）采用免疫组化和流式细胞仪检测MG7Ag在胃癌耐药细胞及其亲本 细胞的表达差异；（ 0）采用 MM实验观察单克隆抗体 MG7对胃癌耐药细 胞药物敏感性的影响，采用流式细胞仪检测MG7对胃癌耐药细胞胞内药物蓄 积的影响。 结果： 门）建立了不同耐药指数的耐药细胞亚系 SGC7901／VCR（0．3Ug／ttilL SGC7901／VCR（口．7ug／inl）、SGC7901／VCR（＊＂g／ml），耐药相关分子 Pgp、 MGrlAg等在耐药细胞亚系中的表达随耐药指数的增加而升高。细胞耐药后 形态也发生了明显的变化，细胞体积变大，呈多角状，绒毛变多变长，细胞 与细胞之间类似于神经细胞突触样的联系增多：细胞内线粒体丰富，细胞与 细胞之间有部分融合现象。 （二）普通型 PKC的四种亚型在胃癌耐药细胞亚系及其亲本细胞均有表 达：随耐药浓度的增加，P＊C。的表达呈逐渐升高的趋势，而＊＊Cp、p 11及 Y的表达无明显变化；给予抗 PKC Q的抗体与耐药细胞共同孵育后，耐 药细胞内药物浓度增加，且有浓度依赖性：而抗叫Ce、p 11或Y的抗体对 细胞内药物浓度无明显影响。 臼）随耐药指数的增加，PKC的活性也呈逐渐增加的趋势，以细胞质的 PKC活性增高为主。给予 PKC的激活剂 PMA omin，细胞膜 PKC活性明显 增高，细胞质PKC活性降低，30ITiln后随时间的延长全细胞的PKC活性均 减低：给予P＊C的抑制剂＊7不同时间后均出现P＊C活性降低。单克隆抗体 ．4． 第四军医大学博士学位论文 一 MGr－l与耐药细胞共同孵育后，耐药细胞PKC的活性减低，以细胞质的PKC 降低比较明显。 （4）与其亲本细胞比，耐药细胞活性PKA百分比明显减低。 6）胃癌耐药细胞 SS790lNCR门．0 Ug／l）与其亲本细