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角蛋白及IL-20在银屑病动物模型中的分子机制研究及反义寡核苷酸基因治疗

樊平申  
【摘要】: 银屑病是一种皮肤科常见并易复发的慢性炎症性皮肤病,其发病原 因极其复杂,至今尚未完全明了。研究报道它与感染、内分泌机能障 碍、免疫功能紊乱、酶的改变及遗传因素等相关。近年来许多学者认 为T细胞的激活是银屑病发病的关键环节。角质形成细胞和皮损区浸 润的T细胞可视为银屑病的主角,它们产生各种细胞因子,形成一个 特殊的网络。在细胞因子的作用下,促使表皮呈现银屑病特征性的过 度增殖。银屑病的组织病理学主要表现为角质形成细胞过度增生、炎 症细胞聚集和真皮乳头部血管扩张三大特征,其中,角质形成细胞过 度增生又是最主要的特点。角质形成细胞过度增生常常伴有异常角化 过程,组织学表现为角化不全及颗粒细胞层消失,而生物化学则表现 为细胞角蛋白的表达异常。正常表皮角蛋白表达模式为:基底层主要 由K5/K14组成,基底层以上部分由K1/K10组成。而银屑病表皮角蛋 白的表达模式发生了明显的变化,基底层以上部分出现了小分子量的 角蛋白,角蛋白K14则呈现出较正常表皮过量的表达,但正常表皮所 第口翠巨大学俗士学位论不 表达的*从10被代表过度增殖的角蛋白K6瓜 所代替。银屑病患者 皮损区表达角蛋白K6、K14、K16的现象提示在这些角蛋白中可能存在 激活银屑病特异性T细胞的自身关键表位。 在诸多细胞因子中,IL《0是最新被发现的一种能在正常人和银 义 屑病患者体内起广泛调节作用的细胞因子。研究发现,IL《0在体外 可以促进角质形成细胞的增殖;IL-20的转基因小鼠可以出现明显的 皮肤损害,其组织病理学改变与银屑病患者的皮损具有惊人的相似; IL-20受体是由a、D两个亚单位组成的异二聚体,两种受体亚单位 在人类正常皮肤中表达水平很低,而在银屑病患者皮损中表达显著增 高,提示IL-20在表皮功能和银屑病发病中具有重要意义。 为了能够更好地研究银屑病的发病机制,曾经有学者设计了多种 动物模型,其中心得安乳剂外涂所致豚鼠耳背部皮肤产生银屑病样皮 损的方法简单易行。 为进一步从分子水平研究此种银屑病动物模型的可行性及其在应用 研究中的使用前景,本实验拟进行:1)5呢心得安乳剂外涂豚鼠耳背部 诱导银屑病样皮损,以建立豚鼠银屑病的动物模型,并证实该方法的 可重复性。2)检测动物模型皮损中几-20及角蛋白K14、K16、K17的 表达水平。3)应用几七0和m 的反义寡核昔酸处理动物皮损,并观 察动物模型皮损的改善程度。4)证实反义寡核昔酸局部外用在治疗包 括银屑病在内的皮肤病中的可行性。 实验中首先取20只健康成年豚鼠(体重3004009,性别不拘人应 用5%C’得安乳剂外涂豚鼠双耳背部皮肤,每日3次,连续涂4周。取 t 材后切片,HE染色。结果显示:全部标本共40份均可见到不同程度 的棘层肥厚、角化不全、表皮突延伸呈棒状、真皮乳头上伸杆状变及 毛细血管扩张。应用组织评分法(典型的银屑病皮损评分在4.0-10.0 3 — — 之间)的计算结果显示:实验组组织学评分为7.5648土0.6425,正常 对照组组织学评分为0.7582土0.1264,经统计学处理显示差异非常显 著(P<0.of)。 应用原位杂交技术,分别检测了实验组和对照组的豚鼠耳背部皮 损的几-20、K14、K16和K17mRNA的表达情况。同时根据几-20的核 昔酸序列设计了PCR引物和探针,提取两组动物相应部位的组织mRNA 做反转录NR(RT-PCR),并与几-20原位杂交的检狈结果相对照。 结果表明实验组皮损角质形成细胞中几七0、K14和K16的表达显 著增加,而K17与对照组相比无明显差异。对几《0而言,实验组40 份标本中,31份应用 RT-PCR可检测到 IL-20有高表达,检测率为 77%。 而对照组表达阳性率只有25%u0份标本中5份检测出有表达,但均 为低表达人 这与应用几《0核酸探针原位杂交的实验结果基本一致。 为了进一步了解几-20、K16在动物模型皮损发生中的作用,本 实验设计并合成了针对几-20和K16的反义寡核昔酸片段。选择20只 豚鼠用5$心得安乳剂诱导双耳产生银屑病样皮损,将针对几-20或K16 的反义寡核昔酸片段配制于乳剂基质中,每组各取10只动物,分别将


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