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抗角蛋白抗体特异识别的角蛋白模拟表位的研究

张亮  
【摘要】: 银屑病是一种具有多基因遗传特性的疾病,其发病机理极其复杂。近年 来许多学者认为T细胞的激活是银屑病发病的中心特征。如银屑病早期皮损 的组织学研究发现,T细胞侵入皮肤促使表皮呈现银屑病特征性的过度增殖。 临床上皮质类固醇、CsA、FK506等免疫抑制剂通过抑制T细胞的激活和细胞 因子的释放而发挥明显的治疗作用。近年来有人用融合了毒素的IL-2清除被 激活的IL-2受体阳性T细胞群,从而使银屑病过度增殖的表皮恢复到正常。 还有人发现抗CD_4单克隆抗体明显改善银屑病的症状。紫外线疗法治疗银屑 病可能通过诱导T细胞亚群的凋亡实现。另一方面,激活的CD_4~+T细胞能够 诱导移植给严重联合性免疫缺陷(SCID)小鼠的银屑病患者自体非皮损区皮 肤产生红斑、鳞屑。进一步的研究发现,从银屑病皮损区分离获得的T细胞 注入到银屑病非皮损区后,可以引发银屑病皮损形成,而从银屑病患者外周 血中获得的T细胞则无此作用。以上结果提示:银屑病皮损区存在特异性T 细胞被激活的现象,而其它来源的T细胞并不被激活,银屑病的皮损是由激 活的特异性T细胞引发。 正常表皮角蛋白表达模式为:基底层主要由角蛋白K5/K14组成,基底层 以上部分由K1/K10组成。银屑病表皮角蛋白的表达发生了明显的变化,基底 层以上部分出现了小分子量的角蛋白,角蛋白K14较正常表皮呈现出过量的 表达,正常表皮所表达的角蛋白K1/K10被逐渐被代表过度增殖的角蛋白 K6/K16历所代替,同时出现了K17的表达。K17的表达及K14表达量的增多被 第四军医大学博士学位论文 认为与银屑病关系更为密切。银屑病患者皮损区表达角蛋白K6、KI4、K16 及K17的现象提示在这些角蛋白中可能存在激活银屑病特异性T细胞的自身 关键表位,并且极有可能是它们的同源保守序列中的某些表位在起作用。另 一方面,链球菌感染可引发点滴型银屑病已为人所共知,而点滴型银屑病可 发展成为慢性斑块型银屑病。M蛋白作为链球菌表面重要的致病性抗原,与 角蛋白在氨基酸保守序列区存在高度同源序列,目前的研究发现,用含有该 同源序列的人工合成肽能够引起银屑病皮损区特异性T细胞的激活,对银屑 病具有积极的致病作用。 天然自身抗体*aturl auoanibodyg NAA)是指在没有任何抗原主动免 疫的条件下,正常机体自觉产生的至少能与一种自身抗原反应的免疫球蛋白, 它们往往识别进化过程中处于自身抗原氨基酸高度保守序列区的具有交叉反 应性的抗原表位。作为 NAA的成员之一,天然抗角蛋白自身抗体(AK auto Ah)理论上可识别角蛋白的位于高度保守序列区的多个表位,在这些表位中 也许含有可激活银屑病特异性T细胞的关键表位。为了验证上述假设,我们 必须首先应用一些实验手段获得 AK auto Ah所识别的角蛋白表位。 表面呈现技术和随机肽库技术的发展,提供了广泛研究抗原表位的空间。 噬菌体表面呈现的短肽不仅可供筛选线性表位,还能模拟不连续表位、糖基 化表位以及其他一些化学修饰肽,利用单克隆抗体可从随机肽库中筛选出相 应的抗原或替代抗原位点。筛选的结果可用作鉴定单抗的结合位点,或筛出 某些有价值的保护性替代抗原,特别是可以搞清病原体关键抗原位点的结构 和功能,为进一步进行短肽疫苗的研究奠定基础。目前,从人工合成或随机 突变获得的噬菌体肽库中利用抗体已成功筛选出了多种病原体的抗原位点或 模拟抗原,井且已证明筛选出的抗原可以刺激动物产生与原抗体相类似的抗 体,并获得免疫保护。库容量越大,筛选出阳性克隆的可能性就越大,相信当 噬菌体库容量足够大时,任一种抗体均可从中筛选出其相应抗原表位或模拟 表位。 3 第四军医大学博士学位论文 本文选用噬菌体表面呈现肽库技术及分子生物学的成熟技术对 AK sllto Ah及1株抗人角蛋白单克隆抗体InAb 5G5进行了三个方面的实验研究,下 面将逐一概述。 一、AK auo Ah所识别的角蛋白抗原表位的研究 AK-81.--O-Ah作为天然自身抗体的成员之一,是存在于血清中的一种多克 隆抗体。本研究利用 AK auo Ah淘筛噬菌体递呈的随机肽库,目的在于获 得在体内具有功能活性的角蛋白模拟表位。但由于 AK auo Ah滴度极低, 在血清抗体中所占的比例小,因而筛选这类抗体的相应自身抗原表位难度非 常大。为了克服此困难,本实验选择角蛋白与 Sepharose 4B耦联,制备角蛋白


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