同型半胱氨酸导致血管内皮功能损伤机理的实验研究

【摘要】： 高同型半胱氨酸血症（HHcy）被公认是一种导致动脉粥样硬化的独 立的危险因素，大约有40％的冠心病和脑血管动脉粥样硬化的患者存在 高同型半胱氨酸血症。但是，Hcy损伤血管壁、导致内皮功能损伤的机 理至今仍不完全清楚，有的实验甚至出现相反的结论。 目的：①、探讨HHcy导致内皮功能损伤时，兔血中NO、ET以及 GSH-PX、SOD活性的改变，从而观察氧化应激在活体内皮功能损伤中 的作用；②、研究抗氧化剂VitC对Hcy导致的兔血管内皮功能损伤是 否具有保护作用，并探讨其机理；③、利用透射电镜观察HHcy时，兔 髂外动脉血管内皮细胞、平滑肌细胞是否出现超微结构的改变；④、通 过培养的HUVEC，研究不同浓度的Hcy对内皮细胞分泌NO、ET的影 响；⑤、通过RT-PCR的方法，研究不同浓度的Hcy是否在转录水平对 HUVEC eNOS产生影响，通过以上的研究探讨Hcy导致内皮功能损伤 的机理。 材料和方法：①、实验一：将兔随机分为两组，每组9只，分别灌 服5.0g/kg体重的L-蛋氨酸（M组）和等量的自来水（N组），然后于4、 8、12、24小时检测其血浆中的NO、ET以及GSH-PX、SOD的活性， 同时利用高分辨力超声检测其EDD、EID，并利用透射电镜观察24小 时后兔髂外动脉超微结构的改变；②、实验二：将兔随机分为三组，每 组9只，分别喂食正常饲料（N组），L-蛋氨酸（0.8/kg体重.天）饲料（M 组），L-蛋氨酸+VitC（1.0/kg体重.天）饲料（MC组），然后于第20、40、 60、80天取血检测NO、ET和GSH-PX、SOD的活性，同时利用高分 辨力超声检测其EDD、EID，并利用透射电镜观察第80天后兔髂外动 脉超微结构的改变；③、实验三：收集HUVEC，然后进行细胞培养， 传至第三代后，将其与不同浓度的Hcy（生理浓度0.01mmol/L、病理生 一 理浓度 0、5 mmol几、非毒性药理浓度 2．0 mmol几、毒‘胜药理浓度 5．0 mmol几）共同培养 24小时，分别在 4、6、8、24小时检测培养液中 NO、 ET的含量，观测 HCy对u者的影响。24小时后，收集 HUVEC，提取 总的NA，然后利用人eNOS特异性引物进行逆转录，再将逆转录的 CDNA进行PCR扩增，最后通过凝胶电泳分析RTFCR的产物，从而探 ＊ Hey对 eNOS fnRNA水平的影响。 结果：①、急性HH叮时，M组兔骼外动脉的EDD较对照组显著降 低，且呈明显的时间依赖性（0小时，！253土18＊％4小时，！584凹！O％： 8小时，！．36凸81W12小时，－！56幻．！3％；24小时，357幻15％，p＜ 0．of）；而曰D无明显的改变；②、急性 HHCy时，M组兔血浆中 NO 较对照组明显降低（对照组，248．52士27．56 u mol／L vs M组 0，］、时， 216！3土31二8卜mol儿；4，h时川05刃土16．57卜mol儿；8小时，！04．38土1003 u mo几：12’h时门门63幻964卜 Inol儿：24’h时，8302述889卜 mo！几， p＜005），血浆ET却明显升高（对照组，168．47土37．52pg／Illl VS M组 0小时，18753t575！pyll：4’h时，262！31079！Pyl＊l。8 ，hD， 38733幻5、25略M；12小时，45255幻2．84吟M：24小＊，37026H372 p分川，p＜00＊，而血浆中 GSH干X和 SOD的活性与对照组之间无明 显差异：③、慢性 HCy时，MC组 （8天，349t 207％）和 M组旧0 天，926L273％）的 EDD均较对照组（80天，987L3门％）明显降低， p＜co！，而且两组之间山差异明显，p＜00！。与急性HH叮不同，慢性 HHcy的 MC组（80天，18．94t405％）和 M组（80天，1694t593％） 的＊D亦较对照组旧0天，2773姐11％〕明显降低，p＜005，但两者 之间无明显差异。④、慢性 HHCy时，M组（8天，209刊到．50if ffiol几） 血浆NO较对照组（386．27t3567 u mow）和MC组（80天，32755t22．57 u mow）均明显降低，p＜0刀5，而 MC组和对照组之间无明显差异。 但是M组（80天，247．4肚26刀6pg／＊l）和MC组（80天，289、1615522 2 一 p旮ml）血浆 ET却较对 组（19092f3430 p旮ml）明显升高，p＜005， 而M组和＊C组之间无明显差异；⑤、慢性HH cy时，M组、＊C组 血浆 SOD活性均与对照组无明显差异，但 M组血浆 GSH－PX活性（80 天汀 12575L16．28活力单位）却较对照组（门662t2338活力单位）和 ＊C组旧0天，19033土25石4活力单位）明显降低，p＜005，而＊C组 和对照组之间无明显差异；③、EDD与血浆NO呈现明显的正相关（，064， p＜0刀1），而与血浆＊T呈现明显的负相关（，刀刀，p＜OO！）二①、