幽门螺杆菌空泡毒素基因分段克隆、表达和活性研究

【摘要】： 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，简称Hp）是定植于人胃部的一种革 兰氏阴性菌，它与慢性胃炎、消化性溃疡、粘膜相关淋巴样组织性淋巴 瘤、胃癌等疾病的发生密切相关，它的感染率高，并且因为人免疫系统 无法根除而长期生存于人的胃部。空泡毒素基因的表达产物—VacA （vacuolating cytotoxin A）是Hp所特有的分泌性毒素，是Hp的重要毒力 因子，在体外，它能使哺乳动物上皮细胞发生空泡样变化，最终导致细 胞死亡，它与Hp感染者的发病与否相关。 在本研究工作中，我们首先对vacA基因进行分段克隆、表达。根 据菌种CCUG 17874的VacA基因序列设计六对引物，以Hp菌株NCTC 11638的总DNA为模板，扩增出vacA基因A、B、C、D、E和F六个 片段，测序证实与文献报道的完全一致，将它们分别克隆入融合表达载 体pRSETA，构建重组融合表达载体pRSET-vacA，转化大肠杆菌 第四军医大学博士学位论文 SL刀＊臼O…a，经IP＊G诱导，表达了五个氨基端融合＊ 的＊。A 片段田、C、D、E和F卜光密度扫描结果表明，融合蛋白分别占菌体 总蛋白的 47．8％、31．8％、43．6％、43．2％和 22．7％，表达产物的相对分 子量分别为33000、20240、26300、27500和32450，均以包涵体形式 存在。在smol／L ＄存在条件下，His。B和His。－D的包涵体溶解，利用 HIS。与过渡金属离子 Ni》高亲和力结合的性质，用 Ni＼ NTA亲和树脂 一步法纯化，获得纯度分别为98％和92％的＊、E和＊－D。他幻e— hi。t实验表明，所表达的融合蛋白能识别抗VacA的多克隆抗体。 之后，我们分别将诱导表达的＊。召和mcD PAGE胶切下，用 中性脱色液调整pH值，免疫成年纯种新西兰大白兔，共免疫注射四次。 用 Western七lot方法测定血清效价，His。o抗血清的效价为 1：1000～l： 10000；HIS厂D的为 1：10000～l：100000。同时用亲和纯化、并复性 的＊厂B检测正常人和部分上消化道疾病患者血清中抗VaCA的抗体， 在285份血清标本中，有77份为阳性，阳性率为26．9％，其中正常人 血清阳性率为 28％K7八）；十二指肠球部溃疡患者血清的阳性率为 14％口14）；胃渍疡患者的为22％C9X 胃炎患者的为38％＊侣卜 胃癌 患者的为33W6川8）：食管癌患者的为22W12乃5h 上消化道出血患者 的为14％＊厂；另有6份其它疾病患者的阳性率为67％w6卜 我们根据真核表达载体pIRES厂EGFP多克隆位点的内切酶顺序， 重新合成四对引物，在获得的原核重组克隆载体pGEMwacA基础上， 扩增vacA基因六个片段爬、NC、ND、NE、NG和NH卜测序证实 与文献报道的完全一致，将它们分别克隆入真核表达载体pIRES。－ EGFP，构建带有绿色荧光蛋白pFP）标签的重组真核表达载体pIRES。－ NvacA，将重组质粒转染到HeLa细胞，检测具有空泡毒素活性的片段， 通过透射电镜观察可知，片段NB和NG具有空泡毒素作用，并且片段 5 第四军医大学博士学位论文 NB是本研究的最小空泡毒素活性片段。 ELISA的血清学检查是 Hp流行病学调查的首选方法，而疫苗接种 是有效控制和彻底消灭蜘感染的最佳途径。本文分段克隆、表达了与 协感染者发病密切相关的空泡毒素基因。在此基础上制备抗空泡毒素 的抗血清，并用临床血清检测重组蛋白的抗原性。同时构建重组真核表 达载体，借助于基因转染检测具有空泡毒素活性的片段。为进一步在临 床上通过检测血清中抗体筛查伽感染者和制备蜘疫苗用于协感染 的预防和治疗奠定基础。