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幽门螺杆菌空泡毒素基因分段克隆、表达和活性研究

江红  
【摘要】: 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,简称Hp)是定植于人胃部的一种革 兰氏阴性菌,它与慢性胃炎、消化性溃疡、粘膜相关淋巴样组织性淋巴 瘤、胃癌等疾病的发生密切相关,它的感染率高,并且因为人免疫系统 无法根除而长期生存于人的胃部。空泡毒素基因的表达产物—VacA (vacuolating cytotoxin A)是Hp所特有的分泌性毒素,是Hp的重要毒力 因子,在体外,它能使哺乳动物上皮细胞发生空泡样变化,最终导致细 胞死亡,它与Hp感染者的发病与否相关。 在本研究工作中,我们首先对vacA基因进行分段克隆、表达。根 据菌种CCUG 17874的VacA基因序列设计六对引物,以Hp菌株NCTC 11638的总DNA为模板,扩增出vacA基因A、B、C、D、E和F六个 片段,测序证实与文献报道的完全一致,将它们分别克隆入融合表达载 体pRSETA,构建重组融合表达载体pRSET-vacA,转化大肠杆菌 第四军医大学博士学位论文 SL刀*臼O…a,经IP*G诱导,表达了五个氨基端融合* 的*。A 片段田、C、D、E和F卜光密度扫描结果表明,融合蛋白分别占菌体 总蛋白的 47.8%、31.8%、43.6%、43.2%和 22.7%,表达产物的相对分 子量分别为33000、20240、26300、27500和32450,均以包涵体形式 存在。在smol/L $存在条件下,His。B和His。-D的包涵体溶解,利用 HIS。与过渡金属离子 Ni》高亲和力结合的性质,用 Ni\ NTA亲和树脂 一步法纯化,获得纯度分别为98%和92%的*、E和*-D。他幻e— hi。t实验表明,所表达的融合蛋白能识别抗VacA的多克隆抗体。 之后,我们分别将诱导表达的*。召和mcD PAGE胶切下,用 中性脱色液调整pH值,免疫成年纯种新西兰大白兔,共免疫注射四次。 用 Western七lot方法测定血清效价,His。o抗血清的效价为 1:1000~l: 10000;HIS厂D的为 1:10000~l:100000。同时用亲和纯化、并复性 的*厂B检测正常人和部分上消化道疾病患者血清中抗VaCA的抗体, 在285份血清标本中,有77份为阳性,阳性率为26.9%,其中正常人 血清阳性率为 28%K7八);十二指肠球部溃疡患者血清的阳性率为 14%口14);胃渍疡患者的为22%C9X 胃炎患者的为38%*侣卜 胃癌 患者的为33W6川8):食管癌患者的为22W12乃5h 上消化道出血患者 的为14%*厂;另有6份其它疾病患者的阳性率为67%w6卜 我们根据真核表达载体pIRES厂EGFP多克隆位点的内切酶顺序, 重新合成四对引物,在获得的原核重组克隆载体pGEMwacA基础上, 扩增vacA基因六个片段爬、NC、ND、NE、NG和NH卜测序证实 与文献报道的完全一致,将它们分别克隆入真核表达载体pIRES。- EGFP,构建带有绿色荧光蛋白pFP)标签的重组真核表达载体pIRES。- NvacA,将重组质粒转染到HeLa细胞,检测具有空泡毒素活性的片段, 通过透射电镜观察可知,片段NB和NG具有空泡毒素作用,并且片段 5 第四军医大学博士学位论文 NB是本研究的最小空泡毒素活性片段。 ELISA的血清学检查是 Hp流行病学调查的首选方法,而疫苗接种 是有效控制和彻底消灭蜘感染的最佳途径。本文分段克隆、表达了与 协感染者发病密切相关的空泡毒素基因。在此基础上制备抗空泡毒素 的抗血清,并用临床血清检测重组蛋白的抗原性。同时构建重组真核表 达载体,借助于基因转染检测具有空泡毒素活性的片段。为进一步在临 床上通过检测血清中抗体筛查伽感染者和制备蜘疫苗用于协感染 的预防和治疗奠定基础。


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